الكشف والتصور من المجمعات البروتين الناجم عن الأضرار الحمض النووي في الثقافات خلية تعليق باستخدام التقريب ربط القرب

يسبب تلف الحمض النووي سلسلة من التنظيمات العالية من الأحداث التي تنطوي على التفاعلات البروتين البروتين والتغييرات بعد متعدية التي تضمن إصلاح فعال وسريع من الحمض النووي، وبالتالي الحفاظ على السلامة الجينية ¹ . عادة، يتم دراسة إصلاح الحمض النووي في الخلايا المعرضة للإشعاع المؤين من خلال رصد تشكيل ما يسمى بؤر الإشعاعات المؤينة (إريف) من قبل (متحد البؤر) المجهر مضان. العديد من إصلاح الحمض النووي والبروتينات الاستشعار عن الضرر الحمض النووي تشكل إريفس، والتي تمثل المجمعات البروتين التي نواة في مواقع الكروماتين الحفاظ على تلف الحمض النووي ^{2 ، 3} . موقع وحل إريفس مع مرور الوقت يعطي نظرة ثاقبة هامة في المنظمة المكانية الزمانية من إصلاح الحمض النووي، وقد تشير إلى تورط مسارات إصلاح الحمض النووي المختلفة. طبيعة الضرر الحمض النووي ومرحلة دورة الخلية التي يتم تحقيق الضرر يحدد أي مسار إصلاح الحمض النووي يتم تفعيلها. فو ، في الخلايا التي تشارك بنشاط في تكرار الحمض النووي (S- المرحلة)، إعادة التركيب مثلي (هر) هو مسار إصلاح الحمض النووي المهيمن، في حين أنه في الخلايا في G1- أو G2 / M- المرحلة من دورة الخلية، متماثل نهاية انضمام (نهيج) مسار إصلاح تسود. واحدة من أقدم الأحداث التي تلحق الضرر الحمض النووي هو تنشيط الحمض النووي كينسيس الاستشعار عن الأكسار أتاكسيا تيلانجيكتاسيا البروتين المتغير (أتم)، التي هي في الغالب نشطة في G1- و G2 / M- مراحل دورة الخلية وينظم نهيج، و أتاكسيا تيلانجيكتاسيا والبروتين ذات الصلة Rad3 (أتر)، الذي يعمل في S- المرحلة من خلال تفعيل الموارد البشرية. كل من أجهزة الصراف الآلي و أتر هي كيناسيس بليوتروبيك جدا أن الفسفوريلات العديد من البروتينات التي تشارك في إصلاح الحمض النووي، موت الخلايا والبقاء على قيد الحياة ⁴ . وقد أظهرت كل من كيناز للفوسفهوريلات وتفعيل p53 البروتين الكابتة للورم بعد التعرض للإجهاد السمية الجينية، مشيرا إلى أن هذه كيناسس هي وسطاء المنبع من محور محوري ورم إشارة قمعية"كريف"> 5 ^{، 6} .

يتم تقييم تكوين وتكوين إيريفس عادة عن طريق تحديد المشاركة في توطين البروتينات المختلفة باستخدام ثنائي اللون تلطيخ المناعي والمجهر، ومع ذلك، ليس كل البروتينات التي هي جزء من المجمعات إصلاح البروتين تشكل إيريفس، مما يحد من تطبيق هذا النهج. وعلاوة على ذلك، (متحد البؤر) المجهر المناعي محدودة بخصائص حيود الضوء، مما أدى إلى قرار المكانية الفقيرة بدلا من حوالي 200-300 نانومتر، وتجاوز حجم معظم الهياكل تحت الخلوية، والتي تحظر أساسا الاستجواب المباشر للتفاعل البروتين البروتين في المستوى الجزيئي. على هذا النحو، والمشاركة في توطين أنماط تلطيخ المناعي كما تم الكشف عنها من قبل (متحد البؤر) المجهر مضان ليست بالضرورة مؤشرا لتفاعلات البروتين البروتين مباشرة. في الآونة الأخيرة، تم تطوير تقنيات فائقة الدقة الجديدة، مثل ستروك ثلاثي الأبعاد(3D-سيم) ⁷ ، والتي استخدمت بنجاح لدراسة 53BP1 و BRCA1 أريف تشكيل على التفاصيل نانو على نطاق، وكشف عن خصائص التوزيع المكاني لهذه البروتينات التي لا يمكن الكشف عن طريق متحد البؤر المسح المجهري بالليزر ⁸ .

ويمكن استخدام العديد من الطرق الأخرى للكشف عن التفاعلات البروتين البروتين في الجسم الحي ، مثل شارك في مناعي، وأساليب المنسدلة والخميرة نهجين الهجينة الفرز. ومع ذلك، فإن هذه التقنيات مرهقة نوعا ما، تتطلب كميات كبيرة من الخلايا أو البروتينات أو تنطوي على أوفيركسريسيون من البروتينات، والذي يدخل التحف التجريبية. في الآونة الأخيرة، وقد تم تطوير تقنية جديدة تسمح التصور وكمي من البروتينات التفاعلات البروتين في الموقع ( أي في الخلايا والأنسجة)، وهو ما يسمى التقريب التقارب التقارب (بلا) ^{9 ، 10} . العلاقات العامةيتم الكشف عن الأجسام المضادة إيماري التي تعترف اثنين من البروتينات من الفائدة من قبل الأجسام المضادة الثانوية التي مترافق إلى قليل النوكليوتيدات (ما يسمى تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى). إذا كان اثنين من الأجسام المضادة الثانوية مختلفة قريبة بما فيه الكفاية بسبب التفاعلات بين البروتينات المعترف بها من قبل الأجسام المضادة الأولية، وأوليغونوكليوتيدس مترافق تهجين ويمكن ليغاتد لتشكيل الركيزة الحمض النووي دائرية مغلقة. يتم تضخيم هذا الركيزة دائرية في وقت لاحق من قبل المتداول دائرة التضخيم، وتصور مع أوليغونوكلأوتيدس التكميلية متلألئ مترافق. باستخدام جيش التحرير الشعبى الصينى، يتم الحفاظ على توطين تحت الخلوية من التفاعل البروتين البروتين كما يبقى فلوريسنتلي المسمى المتداول دائرة التضخيم المنتج تعلق على تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى. القرار من هذا الفحص هو <50 نانومتر، استنادا إلى النتيجة التي يبلغ قطرها الأجسام المضادة حوالي 7-10 نانومتر ¹¹ . المتداول دائرة التضخيم لا يمكن إلا أن تأخذ مكان في حالة اثنين من أزواج من الأجسام المضادة (الابتدائي + سيكونداري) التفاعل الجسدي داخل محيط التي يتم تعريفها من قبل حجمها (10 + 10 + 10 + 10 = 40 نانومتر). خطوة التضخيم إشارة يزيد من حساسية الفحص جيش التحرير الشعبى الصينى ويمكن الكشف عن التفاعلات من البروتينات أعرب بالكاد. جيش التحرير الشعبى الصينى يولد منقط، وبؤر إشارات مثل أنماط التي يمكن كميا على أساس كل خلية، والتي من خلالها يمكن تقييم التباين داخل و خلوي في التفاعلات البروتين البروتين.

تكوين وتكوين المجمعات إصلاح الحمض النووي و إيريفس درس في الغالب في خطوط الخلايا ملتصقة مثل العظام العظام العظام الخلايا الظهارية خط U2OS، الإنسان الجنينية خط خلية الكلى HEK293 والشبكية الشبكية خط الخلايا الظهارية ربي-1، تزايد وسهلة ل ترانسفيكت. وتستخدم الثقافات خلية تعليق مثل الخلايا اللمفاوية وخلايا الخلايا النخاعية أقل في كثير من الأحيان، وهذه هي أقل قابلية للترنسفكأيشن وعموما لا تلتزم كوفرسليبس، مما يتطلب ست /إبس، ب، التصوير. ومع ذلك، فإن حل تلف الحمض النووي ذو صلة كبيرة في سياق الأورام الخبيثة اللمفاوية والخلايا النخاعية، حيث يتأثر رد فعل تلف الحمض النووي في كثير من الأحيان بانحرافات الجينوم (السائق) في هذه الأورام، ولعب دورا محوريا في التحول الخبيث للالمفاوية العادية والنخاعي ( السلف) ^{12 ، 13 ، 14} .

يصف هذا البروتوكول كيف جيش التحرير الشعبى الصينى يمكن استخدامها لتقييم وكمية التفاعلات البروتين البروتين بعد تحريض تلف الحمض النووي في الثقافات خلية تعليق. هنا، يتم تنفيذ جيش التحرير الشعبى الصينى لتحديد وتصور التفاعلات بين أجهزة الصراف الآلي و p53 على تلف الحمض النووي في خلايا سرطان الدم الخلايا B البشرية التي يتم تحريضها للخضوع لل G1 مرحلة اعتقال دورة الخلية. من ملاحظة، بروتوكول المعروضة هنا لا يقتصر على دراسة أتم والتفاعلات p53 في خلايا اللوكيميا اعتقلت G1، ولكن يمكن أن تستخدم أيضا لتصور البروتين البروتين الأخرى إنتيراكتيونس في أنواع الخلايا المختلفة والثقافات خلية تعليق.