Drosophila melanogaster meyve sinekinde çiftleşme davranışını etkileyen çevresel ve genetik ipuçlarını analiz etmeye yönelik bir analiz yapacağız.
Bir kişinin cinsel gücü, genotip, deneyim ve çevresel koşullardan etkilenir. Bu faktörlerin cinsel davranışları modüle etmek için nasıl etkileşim kurdukları çok iyi anlaşılmamıştır. Drosophila melanogasterında , besin mevcudiyeti gibi çevresel ipuçları, cinsel davranışları modüle eden mekanizmaları araştırmak için uyumlu bir sistem sunan çiftleşme aktivitesini etkiler. D. melanogaster'da çevresel ipuçları genellikle kemoterapi tatlısı ve koku sistemleriyle algılanır. Burada, çevresel kimyasal ipuçlarının çiftleşme davranışı üzerindeki etkisini test etmek için bir yöntem sunuyoruz. Tahlil, besin ortamı ve çift çift içeren küçük bir çiftleşme arenasından oluşur. Çiftler için çiftleşme frekansı 24 saat süreyle sürekli olarak izlenir. Burada, bu tahlilin çevresel bileşenleri basınçlı bir hava sistemi vasıtasıyla harici bir kaynaktan denemek için uygulanabilirliğini ve çevresel bileşenlerin doğrudan çiftleşme arenasında manipüle edilmesini sunuyoruz. SenBasınçlı bir hava sisteminin bileşimi, çok uçucu bileşiklerin etkisini test etmek için özellikle faydalıdır, oysa doğrudan eşleşme arenasındaki bileşenlerin manipüle edilmesi, bir bileşiğin varlığını saptamak için değerli olabilir. Bu tahlil, diğer erkek ve dişi üreme davranışlarının yanı sıra, çiftleşme davranışına ve doğurganlığa genetik ve çevresel ipuçlarının etkisi hakkında sorulara cevap verecek şekilde uyarlanabilir.
Üreme davranışları, özellikle erkeklerinkinden daha büyük gametler üreten ve gelişmekte olan yavrularını yükseltmek için koşulları özenle seçmek zorunda kalan dişiler için, genellikle yüksek enerji maliyetlerine sahiptir. Enerji maliyeti nedeniyle, üremenin beslenme koşullarıyla bağlantılı olması şaşırtıcı değildir. Yetişkin beslenme nedeniyle ergenliği ertelenebilen memeliler de dahil olmak üzere hayvanlara rağmen hepsi olmasa da çoğu geçerlidir ve cinsel yönelimleri gıda kısıtlamasından olumsuz yönde etkilenebilir 1 .
Genetik model organizmanın çoğalması Drosophila melanogaster de beslenme koşullarından etkilenir. Gıda uçucuların 2 varlığında yüksek düzeyde Erkekler kortu ve dişiler daha cinsel maya, yumurta üretimi ve yavru hayatta kalma 3, 4, 5 için önemli bir besin varlığında kabul vardır. BuEvrimsel olarak korunan gıda üreme tepkisi, çevresel gıda bulunabilirliğini cinsel üremeye bağlayan mekanizmaları genetik bakımdan ve zamandan tasarruf sağlayan bir organizmada inceleme fırsatı sunar. Gerçekten de, D. melanogaster'taki çalışma insülin yolağını gıda ile çiftleşme ilişkisi arasındaki bağlantının önemli bir regülatörü olarak ortaya koymuştur 6 . Aynı zamanda, çiftleşme hareketi, kadınların gıda tercihlerini ve ayrıca ilişkili kemorensör nöronları 7 , 8 , 9'u değiştirdiğini göstermiştir .
Yemek ipuçlarının D. melanogasterin üreme davranışlarını etkilediği açıktır. Bu etkiler ağırlıklı olarak kadınları, özellikle de 5'i çiftleşmiş olanları etkilemektedir. Bununla birlikte, çevresel koşulların bu akut etkilerini test etmek için, kadın çiftleşme davranışına klasik olarak kullanılan tahlilEşleşen bölümler arasındaki uzun kesintiler nedeniyle çok uygun olmazlar. Klasik iyileştirme tahlilinde bakire bir kadın ilk önce bir erkekle çiftleşir ve hemen izole edilir ve 24 ila 48 saat sonra yeni bir erkekle birlikte sunulur. Bu klasik tahlil, erkek ejakülatının bayan davranışını ve bayan tepkisini değiştiren bileşenleri tanımlamak için büyük başarı elde etti 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Bu nedenle, burada gösterilen sürekli çiftleşme deneyi, üreme davranışları üzerindeki çevresel koşulların akut etkisini incelemek için kullanılabilen klasik çiftleşme deneylerine ektir.
Burada açıklanan çiftleşme davranışı için sürekli tahlil kullanarak, daha önce mayaya maruz kalan bir çift sinekin s24 saatlik bir gözlem süresi 5, 19, 20, 21 üzerinde everal kez, sinekler sadece olacak Remate kez yemek 5 maruz değil ise. Bu bulgu, D. melanogaster literatürünün büyük bir bölümünün ışığında şaşkın olabilir ki, dişilerin ilk çiftleşmeden birkaç gün sonra telafi edilmediğini gösterir (referanslar 10 , 11'de gözden geçirilmiştir ). Bununla birlikte, bu tutarsızlık, yeni bir çiftleşme fırsatı sağlanmadan önce bir ila birkaç gün arasında bir kadının izole edildiği tahlil koşulları ile kolaylıkla açıklanabilir. Eğer bu saatlik gözlem döneminde çift eşleşmezse, kadın kabul edilemez olarak nitelendirilir. Dahası, yüksek çiftleşme sıklığı, yabani yakalanan sineklerin verdikleri verilerin, depolama organlarında 4-6 erkek arasında sperm bulunduğuna göre şaşırtıcı olmamalıdır; Böylece içindeBu dişilerin doğal olarak birkaç kez telafi edildiğini söyleyerek 22 , 23 .
Burada, çiftleşmenin frekansını modüle etmek için sineklerin çevresel koşullar hakkında nasıl bilgi toplayıp bir araya getirdiklerini ortaya çıkarmak için bu sürekli çiftleşme denemesinin kullanımını kanıtlıyoruz. Bu test, genetik çalışmalar için nispeten çok çift çiftin test edilmesini ve uçucu ve uçucu olmayan çevresel ipuçlarının etkisini sınamanızı sağlar. Deney, tipik olarak 24 saat sürer ancak açık-koyu (LD) döngü gibi bisiklet ortamı ipuçlarının test edilmesine olanak tanıyan 48 saate kadar uzatılabilir. Bu tahlil, bir gıda sanayiinde uçucu olmayan maya besin maddesinin mevcudiyeti ile birlikte bir basınçlı hava sistemi içindeki bir maya kültürünün uçucu ipuçlarının etkisini test ederek göstermektedir.
Basınçlı hava sistemi sürekli olarak uçucu ipuçlarını birbirine giren bir arenaya pompalarBir gıda substratı ve bir test çifti (çiftleşme davranışı izlenir). Mayaların etkileşime giren özelliklerini daha ayrıntılı olarak belirlemek için, gıda substratındaki mayaya tekabül eden bir amino asit içeriği ile bir arada, önemli bir uçucu maya bileşikini, yani asetik asit 24'ü , pepton (amino Hayvansal proteinlerin enzimatik sindiriminden elde edilen asitler). Bu deneyler birlikte, D. melanogaster'ın çiftleşme davranışı üzerindeki çevresel ipuçlarının etkisinin bu tahlil ile nasıl test edilebileceğini gösterir.
Bu protokol, çiftleşme çiftinin çiftleşme frekansını belirlemek için kullanıldığı varsayılan çevresel ipuçlarını sürekli kontrol ederken, çiftleşme davranışını 24 saat boyunca test eden bir testi açıklamaktadır. Ortam mayayı da içerdiğinde basınçlı bir hava sistemi vasıtasıyla sağlanan maya havasına yanıt olarak çiftleşme frekansını arttırmak mümkündür ( Şekil 2B ). Ek olarak, çiftleşme frekansında benzer bir tepki, ortamda doğrudan agar, pepton ve aset…
The authors have nothing to disclose.
Sinek stokları için Bloomington Drosophila Stok Merkezi'ne teşekkür ediyoruz; C. Gahr, JT Alkema ve S. van Hasselt, basınçlı hava testini geliştirme konusundaki ilk girişimlerinden; Maya yetiştirme tavsiyesi için Jasper Bosman; Ve Rezza Azanchi ve Joel Levine, orijinal olarak Drosophila çiftleşme davranışının zaman aşımı izlemesini geliştirdiler. JA Gorter bir Neuroscience Araştırma Okulu BCN / NWO Lisansüstü Programı hibe tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, kısmen Hollandalı bilimsel araştırma organizasyonu (NWO) (referans: 821.02.020) tarafından JC Billeter tarafından desteklendi.
Cabinet | |||
Stainless steel kitchen cabinet | Horecaworld | 7412.0105 | |
White LEDs | Lucky Light | ll-583wc2c-001 | Cold white, 20 mAmp and 2 V |
Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
Resistor | Royal Ohm | CFR0W4J0561A50 | 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance |
Smartphone light meter app | Patrick Giudicelli | Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1 | |
Power timer | Alecto | TS-121 | |
Metal brackets | Sharp angle 5 by 5 mm, 2 x 5450 and 1 x 1100 mm long | ||
Frosted glass plate | 1190 x 545 x 5 mm | ||
Filter paper sheets | LEE filters | 220 | White frost |
Small fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292828 | 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM |
Big fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292910 | 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM |
Webcam camera | Logitech | 950270 | B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel |
Camera software | DeskShare | Security monitor pro | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fly rearing | |||
Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
Flypad | Flystuff | 59-114 | |
Wild-type flies | Canton-S | ||
Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25×95 mm |
Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
Molasses | Flystuff | 62-117 | |
Active dry yeast | Red Star | ||
Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
Peptone (bacto) | BD | 211677 | |
Acetic Acid | Merck | 1000631000 | Glacial, 100% |
Small petridish | Greiner bio-one | 627102 | 35 x 10 mm with vents |
Paraffin film | Bemis NA | Parafilm | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Yeast and pressurised air set-up | |||
Big petridish | Gosselin | BP140-01 | 140 x 20.6 mm |
Ultrapure water | Millipore corporation | MiliQ | |
Yeast extract | BD | 212750 | |
Agar (pure) | BD | 214530 | bacto |
Glucose (0(+)-glucose monohydrate) | Merck | 18270000004 | |
Open caps | Schott | 29 240 28 | GL45 |
Silicone septum | VWR | 548-0662 | |
Barbed bulkhead fittings | Nalgene | 6149-0002 | |
Large PVC tubing | diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm | ||
Small PVC tubing | diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm | ||
15 ml tube | Falcon | ||
Aquarium pump | Sera precision | Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar | |
Activated charcoal | Superfish | A8040400 | Norit activated carbon |
Disposible filter unit | Whatman | 10462100 | |
Serological pipettes | VWR | 612-1600 | |
Syringe | BD Plastipak | 300013 | |
Hot glue | Pattex | ||
Syringe filter | Whatman | FP 30/pore size 0.45 mm CA-S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Analysis | |||
Statistics software | R | lme4 package |