Medición de la lipólisis estimulada por Basal y Forskolin en las almohadillas de grasa adiposa inguinal
Summary
Este protocolo describe el método para determinar la lipólisis basal y estimulada por forskolina en almohadillas de grasa inguinal obtenidas de dieta normal de chow (NCD) o dieta con alto contenido de grasa (HFD) ± capsaicina alimentada con ratones de tipo salvaje. Como índice para la lipólisis, la liberación de glicerol se midió a partir de almohadillas de grasa adiposa inguinal.
Abstract
La lipólisis es un proceso mediante el cual el lípido almacenado como triglicéridos en los tejidos adiposos se hidroliza en glicerol y ácidos grasos. Este artículo describe el método para la medición de la lipolisis estimulada basal y forskolin (FSK) en las almohadillas de grasa inguinal aisladas de ratones de tipo salvaje alimentados con dieta normal de chow (NCD), dieta con alto contenido de grasa (HFD) % De capsaicina (CAP, transitorio receptor potencial vanilloid subfamilia 1 (TRPV1) agonista) durante 32 semanas. El método descrito aquí para realizar la lipólisis ex vivo se adopta a partir de Schweiger et al. 1 Presentamos un protocolo detallado para medir los niveles de glicerol mediante espectrofotometría UV-Visible (UV / VIS). El método descrito aquí puede utilizarse para aislar con éxito almohadillas de grasa inguinal para mediciones de lipólisis para obtener resultados consistentes. El protocolo descrito para almohadillas de grasa inguinal se puede extender fácilmente para medir la lipólisis en otros tejidos.
Introduction
Los tejidos adiposos almacenan la energía como grasa 2 y la oxidación de ácidos grasos es necesaria para la termogénesis 3 , 4 . Los ácidos grasos ingeridos a través de las dietas se empaquetan junto con apoproteínas en quilomicrones y entregado a diferentes tejidos en el cuerpo a través de la circulación sanguínea. Aunque la mayoría de las células del cuerpo almacenan una reserva de energía, el tejido adiposo almacena el exceso de energía como grasa 5 , 6 . La lipólisis en el tejido adiposo está regulada por procesos complejos y los detalles moleculares de la lipólisis siguen siendo vagos 7 .
La lipólisis es un proceso por el cual los triglicéridos (TGL) almacenados en el tejido adiposo son hidrolizados para producir glicerol y ácidos grasos (FA) por la enzima grasa triglicérida adiposa (ATGL) 8 . Alteraciones en la lipolisis basal y estimulada es una característica de la obesidad. El bAsal está regulada por la activación 9 de ATGL, que convierte TGL en diacilglicerol (DAG), que posteriormente se hidroliza en monoacilglicerol (MAG). La activación de la lipasa sensible a las hormonas (HSL) a través de la adenilil ciclasa activa la estimulación de la proteína quinasa A (PKA) dependiente del adenosina monofosfato cíclico (cAMP) y provoca la lipólisis. La medición de la lipólisis, basal y estimulada, es, por lo tanto, importante para analizar la actividad de las proteínas implicadas en este proceso. También, desentrañar la regulación molecular de la lipólisis puede ser beneficioso para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas contra la obesidad [ 10] . Dado que las moléculas que estimulan la lipólisis y la oxidación de ácidos grasos son potenciales candidatos para disminuir las grasas almacenadas en los depósitos, es importante emplear un ensayo robusto para la reproducibilidad.
Los datos publicados anteriormente sugieren que la activación de la proteína TRPV1 expresada en tejido adiposo blanco por CAP mejorada basalY FSK (activador de adenilil ciclasa) lipólisis estimulada en almohadillas de grasa inguinal [ 11] . La investigación anterior también sugiere que la activación a largo plazo de TRPV1 por PAC activa PKA [ 12] . Puesto que la activación de la PKA estimula la lipólisis 13 , 14 , la medición de la lipólisis estimulada basal y dependiente de PKA en almohadillas de grasa inguinal aisladas de ratones alimentados con NCD o HFD (± CAP) después de 32 semanas de alimentación de las dietas respectivas validará el papel de TRPV1 Activación en la lipólisis.
Este artículo describe un método eficiente para determinar la lipolisis basal y estimulada. Aunque existen otros métodos que emplean isótopos radiactivos de glicerol y una cromatografía líquida de alto rendimiento tediosa o cromatografía de gases / espectrometría de masas para las mediciones 15 , 16 , este método ofrece una forma más directa, simple y rentableTécnica para determinar la lipólisis en tejidos adiposos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El proceso de degradación de TGL en glicerol y ácidos grasos es catalizada por ATGL 9 durante la lipólisis basal y orquestada por una serie de proteínas, incluyendo la activación de la adenilil ciclasa / PKA dependiente vía durante la lipolisis estimulada [ 21 , 22 , 23] . Aumento de la lipólisis aumenta los niveles plasmáticos de ácidos grasos para el transporte y el uso de energía [ <sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Premio de la AHA N º 15BGIA23250030, el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los NIH bajo el número de adjudicación 8P20 GM103432-12 y la Universidad de Wyoming Beca de la Facultad de Ayuda a BT.
Materials
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
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