Измерение базального и форсколин-стимулированного липолиза в паховых жировых жировых подушечках
Summary
В этом протоколе описывается метод определения базального и форсколин-стимулированного липолиза в паховых жировых подушечках, полученных из обычной диеты для чау-чау (NCD) или диеты с высоким содержанием жиров (HFD) – капсаицина, кормящих мышей дикого типа. В качестве показателя для липолиза высвобождение глицерина измеряли из пастиковых жировых подушечек.
Abstract
Липолиз представляет собой процесс, посредством которого липид, хранящийся в виде триглицеридов в жировых тканях, гидролизуется в глицерин и жирные кислоты. В этой статье описывается метод измерения базального и форсколинового (FSK) -стимулированного липолиза в паховых жировых подушечках, изолированных от мышей дикого типа, получающих либо нормальную диету чау (NCD), диету с высоким содержанием жиров (HFD), либо диету с высоким содержанием жира, содержащую 0,01 % Капсаицина (CAP, транзиторный рецепторный ванилоидный подсемейство 1 (TRPV1) агонист) в течение 32 недель. Способ, описанный здесь для проведения липолиза ex vivo, принимается Schweiger et al. 1 Мы представляем подробный протокол для измерения уровня глицерина с помощью спектрофотометрии УФ-видимой (УФ / ВИ). Описанный здесь способ можно использовать для успешной изоляции паховых жировых подушечек для измерений липолиза для получения согласованных результатов. Протокол, описанный для пастиковых жировых прокладок, можно легко расширить, чтобы измерить липолиз в других тканях.
Introduction
Жировые ткани хранят энергию, поскольку жир 2 и окисление жирных кислот необходимы для термогенеза 3 , 4 . Жирные кислоты, проглатываемые через диеты, упаковываются вместе с апопротеинами в хиломикроны и доставляются в различные ткани в организме посредством кровообращения. Хотя большинство клеток в организме сохраняют запас энергии, жировая ткань сохраняет избыточную энергию как жир 5 , 6 . Липолиз в жировой ткани регулируется сложными процессами, а молекулярные детали липолиза все еще остаются неопределенными 7 .
Липолиз представляет собой процесс, посредством которого триглицериды (TGL), хранящиеся в жировой ткани, гидролизуются с получением глицерина и жирных кислот (FA) ферментной жировой триглицеридной липазой (ATGL) 8 . Изменения в базальном и стимулированном липолизе являются характерной чертой ожирения. БАсальный липолиз регулируют посредством активации ATGL 9 , которая превращает TGL в диацилглицерин (DAG), который затем гидролизуется до моноацилглицерина (MAG). Активация чувствительной к гормону липазы (HSL) посредством аденилилциклазы активирует циклическую аденозинмонофосфатную (цАМФ) зависимую протеинкиназу A (PKA) и вызывает липолиз. Поэтому измерение липолиза, базального и стимулированного, важно для анализа активности белков, участвующих в этом процессе. Кроме того, распутывание молекулярной регуляции липолиза может быть полезным для разработки новых терапевтических стратегий против ожирения 10 . Так как молекулы, которые стимулируют липолиз и окисление жирных кислот, являются потенциальными кандидатами для снижения содержания жира в хранилищах, важно использовать надежный анализ для воспроизводимости.
Ранее опубликованные данные свидетельствуют о том, что активация белка TRPV1, экспрессированного в белой жировой ткани с помощью CAP,И FSK (аденилатциклазный активатор) – стимулированный липолиз в паховых жировых подушечках 11 . Предыдущие исследования также показывают, что долгосрочная активация TRPV1 с помощью CAP активирует PKA 12 . Поскольку активация PKA стимулирует липолиз 13 , 14 , измеряя как базальный, так и PKA-зависимый стимулированный липолиз в паховых жировых подушечках, изолированных от мышей с НИЗ или HFD (± CAP) после 32 недель кормления соответствующих диет, подтвердит роль TRPV1 Активация в липолизе.
В этой статье описывается эффективный метод определения базального и стимулированного липолиза. Хотя доступны другие методы, в которых используются радиоактивные изотопы глицерина и утомительной высокоэффективной жидкостной хроматографии или газовой хроматографии / масс-спектрометрии для измерений 15 , 16 , этот метод предлагает более прямые, простые и экономичныеДля определения липолиза в жировых тканях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Процесс распада TGL в глицерин и жирные кислоты катализируется ATGL 9 во время базального липолиза и организован группой белков, включая активацию аденилилциклазы / PKA-зависимого пути во время стимулированного липолиза 21 , 22 , 23</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Премия AHA № 15BGIA23250030, Национальный институт общих медицинских наук NIH под номером 8P20 GM103432-12 и грант факультета Университета Вайоминга по оказанию помощи BT.
Materials
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
References
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ. Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).
- Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).
- Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).
- Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).
- Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
- Langin, D. Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome. Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).
- Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis. Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).
- Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S., Greenberg, A. S. Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes. J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).
- Kolditz, C. I., Langin, D. Adipose tissue lipolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).
- Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms. Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).
- Yang, D., et al. Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension. Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).
- Ding, L., et al. Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity. Sci Rep. 6, 34374 (2016).
- Ohyama, K., et al. A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).
- Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer. J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).
- Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers. Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).
- Baskaran, P., et al. TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue. Int J Obes (Lond). , (2017).
- Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis. Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
- Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes. Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).
- Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).
- Jeppesen, J., Kiens, B. Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise. J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).
- Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids. Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).
- Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels. Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).
- Barbera, M. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell. J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).
- Leung, F. W. Capsaicin as an anti-obesity drug. Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).
- Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. Thermogenic ingredients and body weight regulation. Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).
- Kang, J. H., et al. Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet. Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).
- Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog. Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).
- Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes. Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).
