מדידה של ליפוליזה מגורה של Basal ו- Forskolin במרפאות שומן אדיפוז
Summary
פרוטוקול זה מתאר את השיטה של קביעת lipolysis basal ו-forskolin מגורה ב pads שמנים השתן המתקבל דיאטה chow נורמלי (NCD) או דיאטה שומן גבוהה (HFD) ± capesicin מזין עכברים סוג בר. כמדד לליפוליזה, שחרור גליצרול נמדד מתוך רפידות שומן שומניות.
Abstract
Lipolysis הוא תהליך שבו שומנים שומנים כמו טריגליצרידים ברקמות השומן הם hydrolyzed לתוך גליצרול וחומצות שומן. מאמר זה מתאר את השיטה למדידת ליפוליזה מבושלת בסיסית ו- forskolin (FSK) בשומן השומן המבודד המבודד מעכברים מסוג בר, שאוכלו גם דיאטה רגילה של צ'או (NCD), דיאטה עשירה בשומן (HFD) או דיאטה דלת שומן המכילה 0.01 % Capsaicin (CAP; קולטן חולף פוטנציאלי וניליל תת-קרקע 1 (TRPV1) אגוניסט) במשך 32 שבועות. השיטה המתוארת כאן לביצוע lipolysis vivo לשעבר מאומצת Schweiger et al. 1 אנו מציגים פרוטוקול מפורט למדידת רמות גליצרול על ידי UV-Visible (UV / VIS) spectrophotometry. השיטה המתוארת כאן ניתן להשתמש בהצלחה לבודד רפידות שומן השמנה עבור מדידות lipolysis להשיג תוצאות עקביות. פרוטוקול המתואר עבור רפידות שומן השד יכול בקלות להיות מורחבת למדוד ליפוליזה ברקמות אחרות.
Introduction
רקמות שומן שומרות אנרגיה כמו שומן 2 וחומצת שומן חומצה נדרשת עבור thermogenesis 3 , 4 . חומצות שומן שמקורן בדיאטות הן ארוזות יחד עם אפופרוטאינים לתוך chylomicrons ונמסר לרקמות שונות בגוף באמצעות זרימת הדם. למרות שרוב התאים בגוף לאחסן עתודה של אנרגיה, רקמת שומן שומרת עודף אנרגיה כמו שומן 5 , 6 . ליפוליזה ברקמת השומן מוסדר על ידי תהליכים מורכבים הפרטים המולקולריים של ליפוליזה עדיין להישאר מעורפל 7 .
ליפוליזה היא תהליך שבו טריגליצרידים (TGL) מאוחסנים ברקמת השומן הם הידרוליזה לייצר גליצרול וחומצות שומן (FA) על ידי אנזים טריפליצרידים ליפאז (ATGL) 8 . שינויים ב ליפוליזה בסיסית ומעוררת היא תכונה אופיינית להשמנה. בAsal lipolysis הוא מוסדר על ידי הפעלת ATGL 9 , אשר ממיר TGL כדי diacylglycerol (DAG), כי הוא hydrolyzed לאחר מכן כדי monoacyl גליצרול (MAG). הפעלה של ליפז רגיש להורמון (HSL) באמצעות cyclase adenylyl מפעיל מחזורית אדנוזין monophosphate (cAMP) חלבון תלוי קינאז A (PKA) גירוי גורם ליפוליזה. מדידה של ליפוליזה, בסיס ומעוררת, היא, אם כן, חשוב לנתח את הפעילות של חלבונים המעורבים בתהליך זה. כמו כן, unraveling את הרגולציה המולקולרית של lipolysis עשוי להיות מועיל לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות נגד השמנה 10 . מאז, מולקולות המעוררות lipolysis וחומצת שומן חומצה הם מועמדים פוטנציאליים עבור שומנים מופחת המאוחסן במחסנים, חשוב להעסיק assay חסון לשחזור.
נתונים שפורסמו בעבר מציעים כי הפעלה של חלבון TRPV1 לידי ביטוי ברקמת השומן הלבנה על ידי CAP משופר הבסיסו FSK (adenylyl cyclase activator) limolysis- מגרה של רפידות שומן המפשעה 11 . מחקרים קודמים גם מציעים כי הפעלה ארוכת טווח של TRPV1 על ידי CAP מפעילה PKA 12 . מאחר והפעלת ה- PKA מגרה ליפוליזה 13 , 14 , מדידת ליפוליזה מגורמת בסיסית ו- PKA תלויות בשומנים שומניים המבודדים מבדיקות NCD או HFD (± CAP) בעכברים לאחר 32 שבועות של הזנת הדיאטות המתאימות יאמת את תפקיד TRPV1 הפעלה בליפוליזה.
מאמר זה מתאר שיטה יעילה לקביעת ליפוליזה בסיסית ומעוררת. למרות שיטות אחרות המעסיקות איזוטופים רדיואקטיביים של גליצרול ומייגע ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית או כרומטוגרפיה גז / ספקטרומטריית מסה עבור מדידות 15 , 16 זמינים, שיטה זו מציעה יותר ישיר, פשוט וחסכוניטכניקה כדי לקבוע lipolysis ברקמות השומן.
Protocol
Representative Results
Discussion
תהליך התמוטטות של TGL לתוך גליצרול וחומצות שומן הוא מזרז על ידי ATGL 9 במהלך ליפוליזה בסיסית מתוזמר על ידי מערך של חלבונים כולל הפעלת adenylyl cyclase / PKA תלוי מסלול במהלך ליפוליזה מגורה 21 , 22 , 23 . שיפור הליפוליזה מג?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי AHA פרס מס '15BGIA23250030, המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של NIH תחת מספר הפרס 8P20 GM103432-12 ואת האוניברסיטה של ויומינג סגל גרנט בסיוע BT.
Materials
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
References
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ. Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).
- Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).
- Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).
- Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).
- Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
- Langin, D. Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome. Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).
- Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis. Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).
- Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S., Greenberg, A. S. Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes. J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).
- Kolditz, C. I., Langin, D. Adipose tissue lipolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).
- Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms. Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).
- Yang, D., et al. Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension. Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).
- Ding, L., et al. Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity. Sci Rep. 6, 34374 (2016).
- Ohyama, K., et al. A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).
- Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer. J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).
- Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers. Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).
- Baskaran, P., et al. TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue. Int J Obes (Lond). , (2017).
- Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis. Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
- Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes. Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).
- Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).
- Jeppesen, J., Kiens, B. Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise. J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).
- Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids. Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).
- Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels. Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).
- Barbera, M. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell. J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).
- Leung, F. W. Capsaicin as an anti-obesity drug. Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).
- Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. Thermogenic ingredients and body weight regulation. Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).
- Kang, J. H., et al. Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet. Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).
- Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog. Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).
- Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes. Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).
