Messung der Basal- und Forskolin-stimulierten Lipolyse bei Inguinal Adipose Fat Pads
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur Bestimmung der Basal- und Forskolin-stimulierten Lipolyse in Leistenfett-Pads, die aus normaler Chow-Diät (NCD) oder hochfettigen Diät (HFD) ± Capsaicin-gefütterten Wildtyp-Mäusen erhalten wurden. Als Index für die Lipolyse wurde die Glycerinfreisetzung aus Leistenfett-Pads gemessen.
Abstract
Die Lipolyse ist ein Verfahren, bei dem das als Triglyceride in adipösen Geweben gelagerte Lipid in Glycerin und Fettsäuren hydrolysiert wird. Dieser Artikel beschreibt die Methode zur Messung der basalen und Forskolin (FSK) -stimulierten Lipolyse in den Leistenfettkissen, die von Wildtyp-Mäusen isoliert wurden, die entweder normale Chow-Diät (NCD), fettreiche Diät (HFD) oder eine fettreiche Diät mit 0,01 gefüttert wurden % Des Capsaicins (CAP; transientes Rezeptorpotential Vanilloidunterfamilie 1 (TRPV1) Agonist) für 32 Wochen. Die hier beschriebene Methode zur Durchführung der Ex-vivo- Lipolyse wird von Schweiger et al. 1 Wir stellen ein detailliertes Protokoll zur Messung der Glycerinspiegel durch UV-Visible (UV / VIS) -Spektrophotometrie vor. Die hier beschriebene Methode kann verwendet werden, um Leistenfettkissen für Lipolyse-Messungen erfolgreich zu isolieren, um konsistente Ergebnisse zu erzielen. Das für Leistenfettkissen beschriebene Protokoll kann leicht erweitert werden, um die Lipolyse in anderen Geweben zu messen.
Introduction
Adipöse Gewebe speichern Energie als Fett 2 und Fettsäure Oxidation ist für die Thermogenese 3 , 4 erforderlich. Fettsäuren, die durch Diäten eingenommen werden, werden zusammen mit Apoproteinen in Chylomikronen verpackt und über Blutkreislauf an verschiedene Gewebe im Körper abgegeben. Obwohl die meisten Zellen im Körper speichern eine Reserve von Energie, Fettgewebe speichert überschüssige Energie als Fett 5 , 6 . Die Lipolyse im Fettgewebe wird durch komplexe Prozesse reguliert und die molekularen Details der Lipolyse bleiben noch vage 7 .
Die Lipolyse ist ein Verfahren, bei dem Triglyceride (TGL), die im Fettgewebe gespeichert sind, hydrolysiert werden, um Glycerin und Fettsäuren (FA) durch das Enzym adipöse Triglyceridlipase (ATGL) 8 zu erzeugen. Veränderungen in der basalen und stimulierten Lipolyse ist ein charakteristisches Merkmal der Fettleibigkeit. Die bDie asale Lipolyse wird durch die ATGL-Aktivierung 9 reguliert, die TGL in Diacylglycerin (DAG) umwandelt, das anschließend zu Monoacylglycerin (MAG) hydrolysiert wird. Die Aktivierung von hormonempfindlicher Lipase (HSL) über Adenylylcyclase aktiviert die zyklische Adenosinmonophosphat (cAMP) abhängige Proteinkinase A (PKA) Stimulation und bewirkt eine Lipolyse. Die Messung der Lipolyse, basal und stimuliert, ist daher wichtig, um die Aktivität der an diesem Prozess beteiligten Proteine zu analysieren. Auch die Entschlüsselung der molekularen Regulation der Lipolyse kann vorteilhaft sein, um neue therapeutische Strategien gegen die Fettleibigkeit zu entwickeln 10 . Da Moleküle, die die Lipolyse und die Fettsäureoxidation stimulieren, potentielle Kandidaten für die Verringerung der in Depots gespeicherten Fette sind, ist es wichtig, einen robusten Test auf Reproduzierbarkeit zu verwenden.
Bisher veröffentlichte Daten deuten darauf hin, dass die Aktivierung von TRPV1-Protein, ausgedrückt in weißem Fettgewebe, durch CAP-basierteUnd FSK (Adenylylcyclaseaktivator) – stimulierte Lipolyse in Leistenfettkissen 11 . Die bisherige Forschung deutet auch darauf hin, dass die langfristige Aktivierung von TRPV1 durch CAP die PKA 12 aktiviert. Da die Aktivierung von PKA die Lipolyse 13 , 14 stimuliert , wird sowohl die basale als auch die PKA-abhängige stimulierte Lipolyse in Leistenfettpolstern, die nach 32 Wochen nach der Fütterung der jeweiligen Diäten von NCD- oder HFD- (± CAP) -Fed-Mäusen isoliert wurden, die Rolle von TRPV1 validieren Aktivierung in der Lipolyse
Dieser Artikel beschreibt eine effiziente Methode zur Bestimmung der basalen und stimulierten Lipolyse. Obwohl andere Verfahren, die radioaktive Isotope von Glycerin und mühsame Hochleistungsflüssigchromatographie oder Gaschromatographie / Massenspektrometrie für die Messungen 15 , 16 zur Verfügung stellen, verfügbar sind, bietet diese Methode eine direkte, einfache und kostengünstigeTechnik zur Bestimmung der Lipolyse im Fettgewebe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Abbauprozess von TGL in Glycerin und Fettsäuren wird durch ATGL 9 während der Basallipolyse katalysiert und durch eine Reihe von Proteinen einschließlich der Aktivierung des Adenylylcyclase / PKA-abhängigen Weges während der stimulierten Lipolyse 21 , 22 , 23 orchestriert. Verbesserung der Lipolyse erhöht die Plasmaspiegel von Fettsäuren für Transport und Energieverbrauch 24…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der AHA Award Nr. 15BGIA23250030, dem National Institute of General Medical Sciences der NIH unter der Auszeichnung Nummer 8P20 GM103432-12 und der University of Wyoming Fakultät Grant in Aid to BT unterstützt.
Materials
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
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