Meting van basale en forskolin-gestimuleerde lipolyse in buikvlies vetpads
Summary
Dit protocol beschrijft de methode voor het bepalen van basale en forskolin gestimuleerde lipolyse in inguineuze vetkussens die worden verkregen uit normale Chow Diet (NCD) of met hoge vet dieet (HFD) ± capsaicine gevoed wild type muizen. Als een index voor lipolyse werd de glycerol-afgifte gemeten van ingewanden van adipose vetpads.
Abstract
Lipolyse is een proces waarbij de lipide opgeslagen als triglyceriden in vetweefsels worden gehydrolyseerd in glycerol en vetzuren. Dit artikel beschrijft de methode voor de meting van basale en forskolin (FSK) gestimuleerde lipolyse in de ingewanden van de ingewanden die geïsoleerd zijn van wilde type muizen die normaal chow dieet (NCD), dik vet dieet (HFD) of een vet dieet met 0,01 % Van capsaïcine (CAP; transient receptor potential vanilloid subfamily 1 (TRPV1) agonist) gedurende 32 weken. De hier beschreven werkwijze voor het uitvoeren van ex vivo lipolyse wordt aangenomen van Schweiger et al. 1 Wij presenteren een gedetailleerd protocol voor het meten van glycerol niveaus door UV-zichtbare (UV / VIS) spectrofotometrie. De hier beschreven methode kan gebruikt worden om inguineuze vetpadsjes te isoleren voor lipolyse metingen om consistente resultaten te verkrijgen. Het protocol dat wordt beschreven voor inguikende vetpadsjes kan gemakkelijk worden uitgebreid om lipolyse in andere weefsels te meten.
Introduction
Adipose weefsels bewaren energie aangezien vet 2 en vetzuuroxidatie nodig is voor thermogenese 3 , 4 . Vetzuren die door diëten worden ingezet, worden samen met apoproteïnen in chylomicrons verpakken en via bloedcirculatie aan verschillende weefsels in het lichaam afgeleverd. Hoewel de meeste cellen in het lichaam een reserve van energie opslaan, slaat vetweefsel overmatige energie op als vet 5 , 6 . Lipolyse in vetweefsel wordt gereguleerd door complexe processen en de moleculaire details van lipolyse blijven nog vaag 7 .
Lipolyse is een proces waarbij triglyceriden (TGL) opgeslagen in vetweefsel worden gehydrolyseerd om glycerol en vetzuren (FA) te produceren door het enzym adipose triglyceride lipase (ATGL) 8 . Verandering in basale en gestimuleerde lipolyse is een kenmerkend kenmerk van obesitas. De bAsale lipolyse wordt gereguleerd door ATGL activatie 9 , die TGL omzettert naar diacylglycerol (DAG), dat vervolgens wordt geëhydrolyseerd aan monoacylglycerol (MAG). Activatie van hormoon gevoelige lipase (HSL) via adenylyl cyclase activeert cyclische adenosine monofosfaat (cAMP) afhankelijke proteïne kinase A (PKA) stimulatie en veroorzaakt lipolyse. Meting van lipolyse, basaal en gestimuleerd, is daarom belangrijk om de activiteit van eiwitten die bij dit proces betrokken zijn te analyseren. Ook het ontrafelen van de moleculaire regulering van lipolyse kan gunstig zijn voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën tegen obesitas 10 . Aangezien moleculen die lipolyse en vetzuuroxidatie stimuleren, potentiële kandidaten zijn voor het verminderen van vetten die in depots worden opgeslagen, is het belangrijk om een robuuste test voor reproduceerbaarheid te gebruiken.
Eerder gepubliceerde gegevens suggereren dat activatie van TRPV1 eiwit uitgedrukt in wit vetweefsel door CAP versterkte basaleEn FSK (adenylyl cyclase activator) gestimuleerde lipolyse in inguikende vetpads 11 . Vorige onderzoek suggereert ook dat de langetermijnactivering van TRPV1 door CAP het PKA 12 activeert. Aangezien de activatie van PKA lipolyse 13 , 14 stimuleert, waarbij zowel de basale als PKA-afhankelijke gestimuleerde lipolyse in buikvliespads geïsoleerde worden geïsoleerde van NCD of HFD (± CAP) -fed muizen na 32 weken van de voeding van de respectieve diëten, de rol van TRPV1 Activatie in lipolyse.
Dit artikel beschrijft een efficiënte methode om basale en gestimuleerde lipolyse te bepalen. Hoewel andere methoden die gebruik maken van radioactieve isotopen van glycerol en vervelende high performance vloeistofchromatografie of gaschromatografie / massaspectrometrie voor metingen 15 , 16 beschikbaar zijn, biedt deze methode een meer directe, eenvoudige en kosteneffectieveTechniek om lipolyse in vetweefsels te bepalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het afbraakproces van TGL in glycerol en vetzuren wordt gekatalyseerd door ATGL 9 tijdens basale lipolyse en georkestreerd door een reeks eiwitten die de activatie van adenylylcyclase / PKA-afhankelijke weg gedurende gestimuleerde lipolyse 21 , 22 , 23 omvatten. Verbetering van lipolyse verhoogt het plasma gehalte aan vetzuren voor transport en energiegebruik 24 . Vetzuren worden …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de AHA Award nr. 15BGIA23250030, het Nationaal Instituut voor Algemene Medische Wetenschappen van de NIH onder onderscheiding nummer 8P20 GM103432-12 en de faculteitsbijdrage Universiteit van Wyoming in Aid to BT.
Materials
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
References
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ. Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).
- Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).
- Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).
- Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).
- Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
- Langin, D. Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome. Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).
- Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis. Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).
- Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S., Greenberg, A. S. Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes. J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).
- Kolditz, C. I., Langin, D. Adipose tissue lipolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).
- Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms. Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).
- Yang, D., et al. Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension. Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).
- Ding, L., et al. Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity. Sci Rep. 6, 34374 (2016).
- Ohyama, K., et al. A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).
- Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer. J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).
- Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers. Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).
- Baskaran, P., et al. TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue. Int J Obes (Lond). , (2017).
- Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis. Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
- Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes. Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).
- Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).
- Jeppesen, J., Kiens, B. Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise. J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).
- Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids. Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).
- Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels. Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).
- Barbera, M. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell. J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).
- Leung, F. W. Capsaicin as an anti-obesity drug. Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).
- Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. Thermogenic ingredients and body weight regulation. Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).
- Kang, J. H., et al. Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet. Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).
- Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog. Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).
- Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes. Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).
