قياس بازال و فورسكولين تحفيز انحلال الدهون في الأربطة الدهنية الدهنية
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة تحديد تحلل الدهون القاعدية و فورسكولين تحفيز في منصات الدهون الأربية التي تم الحصول عليها من النظام الغذائي العادي تشاو (نسد) أو نظام غذائي عالي الدهون (هفد) ± كابسيسين تغذية الفئران نوع البرية. كمؤشر لتحلل الدهون، تم قياس إطلاق الجلسرين من منصات الدهون الدهنية الأربية.
Abstract
انحلال الدهون هو عملية يتم فيها تحلل الدهون المخزنة على شكل الدهون الثلاثية في الأنسجة الدهنية إلى الجلسرين والأحماض الدهنية. توضح هذه المقالة طريقة قياس تحلل الدهون القاعدية و فورسكولين (فسك) في منصات الدهون الأربية معزولة عن الفئران البرية نوع غذاء إما النظام الغذائي العادي (نسد)، نظام غذائي عالي الدهون (هفد) أو اتباع نظام غذائي عالي الدهون تحتوي على 0.01 ٪ من كبخاخات (كاب؛ مستقبلات عابرة فانيلويد الفصيلة 1 (TRPV1) ناهض) لمدة 32 أسبوعا. يتم وصف الطريقة الموصوفة هنا لأداء خارج الجسم تحلل الدهون من سكويجر وآخرون. 1 نقدم بروتوكول مفصل لقياس مستويات الجلسرين بواسطة الأشعة فوق البنفسجية مرئية (أوف / فيس) الطيفي. الطريقة الموصوفة هنا يمكن استخدامها لعزل بنجاح منصات الدهون الإربية قياسات ليبوليسيس للحصول على نتائج متسقة. بروتوكول يمكن وصفها لبطانات الدهون الإربية يمكن أن تمتد بسهولة لقياس تحلل الدهون في الأنسجة الأخرى.
Introduction
الأنسجة الدهنية تخزين الطاقة والدهون 2 والأكسدة الأحماض الدهنية هو مطلوب ل ثيرموجينيسيس 3 ، 4 . يتم تعبئتها الأحماض الدهنية تناولها من خلال الوجبات الغذائية جنبا إلى جنب مع أبوبروتينز إلى كيلومرونس وتسليمها إلى أنسجة مختلفة في الجسم عن طريق الدورة الدموية. على الرغم من أن معظم الخلايا في الجسم تخزين احتياطي من الطاقة، ومخازن الأنسجة الدهنية الطاقة الزائدة كما الدهون 5 ، 6 . يتم تنظيم انحلال الدهون في الأنسجة الدهنية من قبل العمليات المعقدة والتفاصيل الجزيئية لتحلل الدهون لا تزال غامضة 7 .
تحلل الدهون هو عملية يتم من خلالها تحلل الدهون الثلاثية (تغل) المخزنة في الأنسجة الدهنية لإنتاج الجلسرين والأحماض الدهنية (فا) من قبل الانزيم الدهني الدهون الدهنية (أتغل) 8 . التعديلات في تحلل الدهون القاعدية وتحفيز هو سمة مميزة للسمنة. بيتم تحلل الدهون الشحمية من قبل تفعيل أتغل 9 ، الذي يحول تغل إلى دياسيلغليسيرول (داغ)، التي تحلل في وقت لاحق إلى الجلسرين مونواسيل (ماغ). تنشيط الهرمونات الحساسة للهرمونات (هسل) عن طريق أدينيليل سيكليس ينشط أدينوسين أحادي (كامب) تعتمد البروتين كيناز A (يكا) التحفيز ويسبب تحلل الدهون. قياس تحلل الدهون، القاعدية وتحفيز، وبالتالي، من المهم لتحليل نشاط البروتينات المشاركة في هذه العملية. أيضا، كشف التنظيم الجزيئي لتحلل الدهون قد تكون مفيدة لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة ضد السمنة 10 . وبما أن الجزيئات التي تحفز تحلل الدهون وأكسدة الأحماض الدهنية هي مرشحات محتملة لتخفيض الدهون المخزنة في المستودعات، فمن المهم استخدام مقايسة قوية لإعادة التكاثر.
وتشير البيانات المنشورة سابقا أن تفعيل البروتين TRPV1 أعرب في الأنسجة الدهنية البيضاء من قبل كاب تعزيز القاعديةو فسك (أدينيليل سيكليس المنشط) -حلقة تحلل الدهون في منصات الدهون الأربية 11 . وتشير البحوث السابقة أيضا إلى أن تفعيل طويل الأجل ل TRPV1 بواسطة كاب ينشط يكا 12 . منذ تفعيل يكا يحفز انحلال الدهون 13 ، 14 ، وقياس كل من القاعدية و يكا تحفيز تحلل الدهون في منصات الدهون الأربية معزولة عن الفئران غير سارية المفعول أو هفد (± كاب) بعد 32 أسبوعا من تغذية النظم الغذائية المعنية والتحقق من صحة دور TRPV1 تفعيل في تحلل الدهون.
توضح هذه المقالة طريقة فعالة لتحديد تحلل الدهون القاعدي وتحفيز. على الرغم من أن الطرق الأخرى التي توظف النظائر المشعة من الجلسرين ومملة عالية الأداء اللوني السائل أو كروماتوغرافيا الغاز / مطياف الكتلة للقياسات 15 ، 16 متاحة، وهذا الأسلوب يوفر أكثر مباشرة وبسيطة وفعالة من حيث التكلفةتقنية لتحديد تحلل الدهون في الأنسجة الدهنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم تحفيز عملية انهيار تغل في الجلسرين والأحماض الدهنية من قبل أتغل 9 خلال تحلل الدهون القاعدية ومنسق من قبل مجموعة من البروتينات بما في ذلك تفعيل مسار أدنيليل سيكليس / يكا المعتمدة خلال تحلل الدهون تحفيز 21 ، 22 ، <sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل جائزة أها رقم 15BGIA23250030، والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة تحت الجائزة رقم 8P20 GM103432-12 وجامعة وايومنغ منحة كلية في المعونة ل بت.
Materials
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
References
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ. Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).
- Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).
- Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).
- Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).
- Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
- Langin, D. Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome. Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).
- Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis. Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).
- Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S., Greenberg, A. S. Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes. J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).
- Kolditz, C. I., Langin, D. Adipose tissue lipolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).
- Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms. Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).
- Yang, D., et al. Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension. Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).
- Ding, L., et al. Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity. Sci Rep. 6, 34374 (2016).
- Ohyama, K., et al. A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).
- Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer. J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).
- Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers. Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).
- Baskaran, P., et al. TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue. Int J Obes (Lond). , (2017).
- Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis. Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
- Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes. Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).
- Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).
- Jeppesen, J., Kiens, B. Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise. J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).
- Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids. Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).
- Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels. Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).
- Barbera, M. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell. J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).
- Leung, F. W. Capsaicin as an anti-obesity drug. Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).
- Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. Thermogenic ingredients and body weight regulation. Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).
- Kang, J. H., et al. Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet. Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).
- Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog. Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).
- Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes. Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).
