Pinza de tensión Fluorometría en<em> Xenopus</em> Oocitos Usando Fluorescentes Aminoácidos No Naturales
Summary
Este artículo describe una mejora de la Fluorometría de Voltaje-Clavija convencional (VCF) donde se usan Fluorescentes Aminoácidos No Naturales (fUAA) en lugar de tintes de maleimida, para sondar reordenamientos estructurales en canales iónicos. El procedimiento incluye inyección de ADN de ovocitos de Xenopus , coinjección de ARN / fUAA y mediciones de corriente y fluorescencia simultáneas.
Abstract
Fluorometría de tensión-abrazadera (VCF) ha sido la técnica de elección para investigar la estructura y función de las proteínas de membrana electrogenic donde las mediciones en tiempo real de la fluorescencia y las corrientes informan simultáneamente sobre los reordenamientos locales y la función global, respectivamente 1 . Mientras que las técnicas estructurales de alta resolución como la microscopía cryoelectrónica o la cristalografía de rayos X proporcionan imágenes estáticas de las proteínas de interés, el VCF proporciona datos estructurales dinámicos que nos permiten vincular los reordenamientos estructurales (fluorescencia) a datos funcionales dinámicos (electrofisiología). Hasta hace poco, la química tiol-reactiva utilizada para el marcado fluorescente dirigido a las plantas de las proteínas restringía el alcance del enfoque porque todas las cisteínas accesibles, incluidas las endógenas, estarían etiquetadas. De este modo se requirió la construcción de proteínas libres de cisteínas endógenas. El etiquetado también se restringió a los sitios accesibles desde el extracelularlado. Esto cambió con el uso de aminoácidos fluorescentes no naturales (fUAA) para incorporar específicamente una pequeña sonda fluorescente en respuesta a la supresión del codón de parada utilizando un par ortogonal tRNA y tRNA sintetasa par 2 . La mejora de VCF sólo requiere un procedimiento de inyección de dos etapas de inyección de ADN (par tRNA / sintetasa) seguido de co-inyección de ARN / fUAA. Ahora, el etiquetado tanto intracelular y sitios enterrados es posible, y el uso de VCF se ha expandido significativamente. La técnica VCF se convierte así en atractiva para estudiar una amplia gama de proteínas y, lo que es más importante, permite investigar numerosos mecanismos reguladores citosólicos.
Introduction
Más de 200 aminoácidos naturales de diversas propiedades químicas y físicas han sido incorporados genéticamente en proteínas en células de E. coli , levaduras y mamíferos [ 3] . El aminoácido no natural se incorpora en respuesta a un codón de parada específico a través de un par ortogonal de tRNA / sintetasa. El enfoque genético para modificar las proteínas ha proporcionado información valiosa sobre la estructura y función de la proteína. Aquí, presentamos un protocolo para el uso de Voltaje-Clamp Fluorometría (VCF) en combinación con un fluorescente SAU.
En VCF, la observación simultánea de datos funcionales y reordenamientos estructurales localizados alrededor de la sonda fluorescente (~ 5 Å) nos permite obtener información dinámica con una resolución de milisegundos 1 . Las sondas fluorescentes alteran su estado de extinción tras el movimiento localizado de la proteína. Un movimiento de sólo 1-2 Å es suficiente para conducir a cambios significativos en la fluorescenciaIntensidad 4 . Después de la identificación del sitio de interés en la proteína diana, el sitio es mutado por mutación puntual. Clásicamente, el residuo se había mutado a una cisteína, mientras que ahora, se introduce un codón de detención ámbar (TAG) para la incorporación genética de fUAA. La proteína se transcribe entonces in vitro .
Mientras que otros sistemas de expresión ( p. Ej., Células de mamíferos) pueden usarse 5 , 6 , 7 , los oocitos de Xenopus son preferibles para estudios de estructura-función debido a su mayor tamaño, lo que conduce a una manipulación más fácil ya una mayor intensidad de fluorescencia (más fluoróforos) Ruido. Además, los ovocitos de Xenopus tienen un bajo trasfondo de las proteínas endógenas 2 , 8 , y la pigmentación oscura en el polo animal se escuda contra la fluorescencia de fondo de tEl citosol. Los ovocitos de Xenopus se eliminan quirúrgicamente y el ADN que codifica el par ortogonal tRNA / tRNA-sintetasa específico para la fUAA se inyecta en el núcleo de los oocitos. Después de un tiempo de incubación de 6-24 h, la proteína ARN se co-inyecta con la fUAA en el citosol de los ovocitos, seguido por un período de incubación de 2-3 días. Con el fin de evitar cualquier daño a la fUAA (fotoblanqueo), los procedimientos que incluyen Anap tienen que llevarse a cabo bajo luz roja para evitar la excitación del fluoróforo.
Se estudian los ovocitos en una configuración de tensión-abrazadera de ovocitos abierta, que se monta en un microscopio de fluorescencia vertical, y se registran simultáneamente cambios de corriente eléctrica y fluorescencia 9 , 10 . Alternativamente, pueden usarse una abrazadera de tensión de dos electrodos 1 o configuraciones de abrazadera de parche 11 . La fluorescencia se excita mediante longitudes de onda apropiadas con bajo ruido RMS y Emisión registrada usando un fotodiodo ligado a un amplificador con alta amplificación.
Hay varias ventajas del uso de aminoácidos fluorescentes no naturales (fUAAs) en fluorometría de tensión-abrazadera. Una es el acceso al lado citosólico de las proteínas de la membrana; Aquí se encuentran muchos procesos reguladores ( por ejemplo, sitios de unión a Ca2 + o nucleótidos, inactivación rápida y cerrada de canales iónicos con voltaje, apertura de poros, acoplamiento de módulos). Todos estos procesos ahora son accesibles para el etiquetado fluorescente.
Otra ventaja es el tamaño pequeño de la sonda que conduce a menos alteración de la proteína. Hasta ahora, se han diseñado dos pares ortogonales tRNA / ARNt sintetasa para fUAA 12 , 13 , donde el ácido 3- (6-acetilnaftalen-2-ilamino) -2-aminopropanoico (Anap) es el único fUAA que se ha utilizado en ovocitos de Xenopus 2 ,"Xref"> 8. Anap es un fluoróforo ambientalmente sensible con un peso molecular de 272,3 g / mol y es sólo ligeramente mayor que el triptófano 12 ( Figuras 1A, 1B ). Debido a su pequeño tamaño, es probable que se introduzcan menos efectos estéricos por el fluoróforo en comparación con los fluoróforos convencionales unidos a través de un engarce (típicamente más de 500 g / mol). Por otra parte, en el caso de Anap, el fluoróforo se encuentra más cerca de la cadena principal de proteínas que los vinculados a las cisteínas, y, en consecuencia, Anap está probando más localizados reordenamientos. Por último, la eliminación de las cisteínas endógenas en el VCF convencional con el fin de asegurar el etiquetado específico del sitio ya no es un requisito en el UAA-VCF y por lo tanto (i) deja las proteínas en (casi) su estado nativo y (ii) permite aplicar VCF Para estudiar una gama más amplia de proteínas en las que la función puede ser alterada por la sustitución de cisteína.
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Figura 1 : Anap y espectros de fluorescencia. ( A ) Estructura química de Anap. ( B ) Espectro de absorción normalizado y espectros de emisión para Anap 1 nM, demostrando la sensibilidad de la fluorescencia de Anap a la hidrofobicidad del disolvente. Los espectros de emisión se obtuvieron por excitación a 350 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Una desventaja del uso de UAA fluorescentes es que una población heterogénea de proteínas puede resultar de la lectura de codón de terminación, reiniciación traslacional, proteínas C-terminales truncadas o diafonía con aminoacilación endógena si la cantidad de ARNt aminoacilados es escasa. Tal expresión de fugas siempre debe comprobarse en ausencia de la fUAA y el tRNA / tRNA synthetase par. Abordamos la cuestión de la transReinicialización lacional y cómo evitarlo para los sitios de inserción N-terminal anteriormente 14 . Sin embargo, cuando la fUAA, tRNA y tRNA sintetasa están presentes en cantidades saturadas, sólo queda una baja probabilidad de expresión de fugas.
La principal diferencia de procedimiento entre fUAA-VCF y VCF convencional es la inyección y manipulación de los ovocitos; La inyección de ADN que codifica el tRNA y la ARNt sintetasa (pAnap) es seguida por la introducción de Anap, que se co-inyecta con el ARNm de la proteína o se añade alternativamente a la solución de incubación como un éster de acetoximetilo (AM).
Protocol
Representative Results
Discussion
La aminoacilación in vivo de tRNAs que se transcriben continuamente junto con la tRNA-sintetasa, hace posible obtener altos niveles de expresión para mediciones de fluorescencia. Para una eficaz incorporación de fUAA, es fundamental que pAnap se inyecte correctamente en el núcleo. Debido a la incertidumbre de la ubicación exacta del núcleo, 10-40% de las inyecciones de ADN se espera que fallen, dando lugar a no expresar (o expresar fugas) ovocitos. Por lo tanto, es importante verificar la expresión en au…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PAnap fue un regalo amable del Dr. Peter Schultz (Scripps Research Institute). Este trabajo fue financiado por el Instituto Canadiense de Investigaciones en Salud Subvenciones MOP-102689 y MOP-136894 (a RB) y la Fundación Canadiense para la Innovación Subvención 950-225005.
Materials
| Solutions | |||
| Barth's solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 90mM |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 3mM |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-9397 | 0.82mM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C-7902 | 0.41mM |
| Ca(NO3)2 | Sigma-Aldrich | C-1396 | 0.33mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5mM |
| NaOH hydrate | BDH | BDH7225-4 | pH 7.6 |
| Penicilin | Invitrogen | 15140122 | 100U/mL |
| Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | 100µg/mL |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160054 | 10mg/100mL |
| Horse serum | Invitrogen | 16050122 | 5% |
| SOS Standard Oocyte Solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | 102 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | 3 mM |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | 1 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| External recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Internal recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Labeling solution | |||
| KOH | Fisher Scientific | P250-1 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| TMR stock solution | |||
| Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) | Molcular Probes by Life Technologies | T6027 | 5mM in DMSO |
| Anap stock solution | |||
| Anap | ABZENA (TCRS) | Custom synthesis TCRS-170 | 1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| pAnap | Addgene | 48696 | |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan Corporation | CA-1B | |
| Gpatch Acquisition software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Analysis software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Recording Chamber | Custom machined | ||
| Photo diode detection system | Dagan Corporation | PhotoMax-200/PIN | |
| Electrical shutter driver | UNIBLITZ | VCM-D1 | |
References
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