Braçadeira de tensão Fluorometria em<em> Xenopus</em> Oócitos Usando Aminoácidos Fluorescentes Não-naturais

Mais de 200 aminoácidos não naturais de várias propriedades químicas e físicas foram geneticamente incorporados em proteínas em células de E. coli , leveduras e mamíferos ³ . O aminoácido não natural é incorporado em resposta a um codão de paragem específico através de um par tRNA / sintetase engendrado ortogonalmente. A abordagem genética para modificar proteínas forneceu insights valiosos sobre a estrutura ea função da proteína. Aqui, apresentamos um protocolo para o uso de Fluorometria de Voltagem-Clamp (VCF) em combinação com uma UAA fluorescente.

No VCF, a observação simultânea de dados funcionais e rearranjos estruturais localizados ao redor da sonda fluorescente (~ 5 Å) nos permite obter informações dinâmicas com resolução milissegundo ¹ . As sondas fluorescentes alteram o seu estado de extinção ao movimento localizado da proteína. Um movimento de apenas 1-2 Å é suficiente para levar a alterações significativas na fluorescênciaIntensidade ⁴ . Após a identificação do local de interesse na proteína alvo, o local é mutado por mutação pontual. Classicamente, o resíduo tinha sido mutado para uma cisteína enquanto que agora, um codão de paragem âmbar (TAG) é introduzido para a incorporação genética de fUAA. A proteína é então transcrita in vitro .

Enquanto outros sistemas de expressão ( por exemplo, células de mamíferos) podem ser utilizados ^{5 , 6 , 7} , os oócitos de Xenopus são preferíveis para estudos de estrutura-função devido ao seu maior tamanho, levando a manipulação mais fácil e maior intensidade de fluorescência (mais fluoróforos) Ruído. Além disso, os oócitos de Xenopus têm baixa formação de proteínas endógenas ^{2 , 8} , ea pigmentação escura no pólo animal protege contra a fluorescência de fundo de tEle citosol. Os oócitos de Xenopus são removidos cirurgicamente e o ADN que codifica o par tRNA / tRNA-sintetase ortogonal específico para a fUAA é injectado no núcleo dos oócitos. Após um período de incubação de 6-24 h, a proteína ARN é co-injectada com a fUAA no citosol dos oócitos, seguido por um período de incubação de 2-3 dias. A fim de evitar qualquer dano ao fUAA (foto-branqueamento), os procedimentos incluindo Anap têm de ser levados a cabo sob luz vermelha para evitar a excitação do fluoróforo.

Os oócitos são estudados em uma configuração de braçadeira de tensão de oócito cortada aberta, que é montada em um microscópio de fluorescência vertical, e mudanças de corrente elétrica e fluorescência são registradas simultaneamente ^{9 , 10} . Em alternativa, podem ser utilizadas as configurações de tensão de dois eléctrodos ¹ ou de grampo-grampo ¹¹ . A fluorescência é excitada por comprimentos de onda apropriados com baixo Emissão gravada usando um fotodíodo ligado a um amplificador com alta amplificação.

Existem várias vantagens do uso de aminoácidos fluorescentes não naturais (fUAAs) na fluorometria de tensão-braçadeira. Um deles é o acesso ao lado citosólico das proteínas da membrana; Muitos processos reguladores estão localizados aqui ( por exemplo, Ca2 ⁺ – ou sítios de ligação de nucleotídeos, inativação rápida e fechada de canais iónicos com voltagem, abertura de poros, acoplamento de módulo). Todos estes processos estão agora acessíveis para rotulagem fluorescente.

Outra vantagem é o pequeno tamanho da sonda levando a menos perturbação da proteína. Até agora, dois pares de tRNA / tRNA sintetase ortogonais para fUAAs foram desenvolvidos ^{12 , 13} , onde o ácido 3- (6-acetilnaftalen-2-ilamino) -2-aminopropanóico (Anap) é o único fUAA que tem sido utilizado em oócitos de Xenopus ^{2 ,}"Xref"> 8. Anap é um fluoróforo ambientalmente sensível com um peso molecular de 272,3 g / mol e é apenas ligeiramente maior do que o triptofano ¹² ( Figuras 1A, 1B ). Devido ao seu pequeno tamanho, é provável que sejam introduzidos menos efeitos estéricos pelo fluoróforo em comparação com os fluoróforos convencionais ligados através de um ligante (tipicamente mais do que 500 g / mol). Além disso, no caso de Anap, o fluoróforo está localizado mais próximo do esqueleto da proteína do que os ligados às cisteínas e, consequentemente, Anap está a testar rearranjos mais localizados. Finalmente, a remoção de cisteínas endógenas em VCF convencional para assegurar a marcação específica de sítio não é mais uma exigência em UAA-VCF e portanto (i) deixa as proteínas em (quase) o seu estado nativo e (ii) permite a aplicação de VCF Para estudar uma gama mais ampla de proteínas em que a função pode ser alterada pela substituição de cisteína.

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Figura 1 : Espectro de Anap e Fluorescência. ( A ) Estrutura química de Anap. ( B ) Espectro de absorção normalizado e espectros de emissão para Anap 1 nM, demonstrando a sensibilidade da fluorescência de Anap à hidrofobicidade do solvente. Os espectros de emissão foram obtidos por excitação a 350 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma desvantagem do uso de UAAs fluorescentes é que uma população heterogénea de proteínas pode resultar de leitura de codão de terminação, reiniciação de tradução, proteínas truncadas de terminal C ou crosstalk com aminoacilação endógena se a quantidade de tRNAs aminoacilados for escassa. Tal expressão de vazamento deve ser sempre verificada na ausência do par de ARNt / tRNA sintetase. A questão da transReinicialização lacional e como evitá-la para locais de inserção N-terminais anteriormente ¹⁴ . No entanto, quando a fUAA, tRNA e tRNA sintetase estão presentes em quantidades saturadas, só permanece uma baixa probabilidade de expressão de vazamento.

A principal diferença processual entre fUAA-VCF e VCF convencional é a injecção e manuseamento dos oócitos; A injecção de ADN que codifica o ARNt e a ARNt-sintetase (pAnap) é seguida pela introdução de Anap, que é co-injectado com o ARNm da proteína ou, alternativamente, adicionado à solução de incubação como um éster de acetoximetilo (AM).