電圧クランプ<em>アフリカツメガエル</em>蛍光性の非天然アミノ酸を用いた卵母細胞
Summary
この記事では、マレイミド色素の代わりに蛍光非天然アミノ酸（fUAA）を用いて、イオンチャネルの構造的再配列を調べる従来の電圧クランプ蛍光光度法（VCF）の強化について説明します。この手順には、 アフリカツメガエル卵母細胞DNA注入、RNA / fUAA共注入および同時電流および蛍光測定が含まれる。
Abstract
電圧クランプ蛍光測定法（VCF）は、蛍光および電流のリアルタイム測定が局所再編成および全体的機能について同時に報告する、エレクトロジェニック膜タンパク質の構造および機能を調査するために選択された技術であった1 。低温電子顕微鏡法やX線結晶解析などの高分解能構造技術は、目的のタンパク質の静的画像を提供しますが、VCFは動的再構成（蛍光）を動的機能データ（電気生理学）にリンクさせる動的構造データを提供します。最近まで、タンパク質の部位特異的蛍光標識に使用されたチオール反応性化学は、内因性のシステインを含むすべての利用可能なシステインが標識されるため、アプローチの範囲を制限した。従って、内在性システインを含まないタンパク質を構築することが必要であった。標識はまた、細胞外からアクセス可能な部位に限定された側。これは、直交tRNAおよびtRNAシンテターゼ対2を用いた終止コドン抑制に応答して、小さな蛍光プローブを特異的に組み込むための蛍光不自然なアミノ酸 （fUAA）の使用により変化した。 VCFの改善は、DNA注入（tRNA /シンテターゼ対）の2段階注入手順とそれに続くRNA / fUAA同時注入を必要とするのみである。今や、細胞内および埋設サイトの両方の標識が可能であり、VCFの使用が大幅に拡大している。 VCF技術は広範囲のタンパク質を研究する上で魅力的になり、より重要なことには多数の細胞質ゾル調節機構を調べることが可能になる。
Introduction
大腸菌 、酵母および哺乳動物細胞において、様々な化学的および物理的性質の200種以上の非天然アミノ酸がタンパク質に遺伝子組み換えされている3 。非天然アミノ酸は、直交操作されたtRNA /シンテターゼ対を介して特異的終止コドンに応答して組み込まれる。タンパク質を改変するための遺伝的アプローチは、タンパク質の構造および機能についての貴重な洞察を提供している。ここでは、蛍光UAAと組み合わせてVoltage-Clamp Fluorometry（VCF）を使用するためのプロトコルを紹介します。
VCFでは、蛍光プローブの周囲に局在する機能的データと構造的再構成の同時観察（約5Å）により、ミリ秒の分解能で動的情報を得ることができます1 。蛍光プローブは、タンパク質の局在化した移動の際に消光状態を変化させる。唯一の1〜2Åの移動は、蛍光の顕著な変化をもたらすのに十分である強度4 。標的タンパク質における目的部位の同定の後、部位は点突然変異によって突然変異される。古典的には、残渣はシステインに変異していたが、今では、遺伝的fUAA取り込みのためにアンバーストップコドン（TAG）が導入されている。次いで、タンパク質をin vitroで転写する。
ツメガエル卵母細胞は、他の発現系（ 例えば、哺乳動物細胞）を使用することができるが、サイズが大きいため、操作が簡単で蛍光強度が高い（フルオロホアが多い）ため、ノイズ比に影響します。さらに、 アフリカツメガエルの卵母細胞は、内因性タンパク質2,8に由来するバックグラウンドが低く、tからのバックグラウンド蛍光に対する動物の極の遮蔽に対する暗色色素沈着彼は細胞質ゾルです。 アフリカツメガエル卵母細胞を外科的に除去し、fUAAに特異的な直交tRNA / tRNAシンテターゼ対をコードするDNAを卵母細胞の核に注入する。 6〜24時間のインキュベーション時間後、タンパク質RNAをfUAAと共に卵母細胞の細胞質ゾルに同時注入し、その後2〜3日間のインキュベーション時間をおこなう。 fUAA（光漂白）の損傷を防ぐために、蛍光色素を避けるために赤色光下でAnapを含む手順を実施しなければならない。
卵母細胞は、直立蛍光顕微鏡に取り付けられた切開卵母細胞クランプセットアップで研究され、電流および蛍光の変化が同時に記録される（ 9,10 ） 。あるいは、2電極電圧クランプ1またはパッチクランプ構成11を使用することができる。蛍光は、低いRMSノイズを有する適切な波長によって励起され、高い増幅度を有する増幅器にリンクされたフォトダイオードを使用して記録される。
電圧クランプ蛍光測定に蛍光非天然アミノ酸（fUAA）を使用することにはいくつかの利点があります。 1つは、膜タンパク質の細胞質ゾル側へのアクセスである。 （ 例えば、 Ca 2+ – またはヌクレオチド結合部位、電位依存性イオンチャネルの高速および閉鎖状態の不活性化、細孔開口、モジュール結合）には、多くの調節プロセスが存在する。これらのプロセスはすべて、蛍光標識のためにアクセス可能になりました。
別の利点は、プローブのサイズが小さくなり、タンパク質の妨害が少なくなることである。これまで、3-（6-アセチルナフタレン-2-イルアミノ）-2-アミノプロパン酸（Anap）がアフリカツメガエル卵母細胞に使用されている唯一のfUAAであるfUAAの2つの直交tRNA / tRNAシンテターゼ対が設計されている図2に示すように 、"xref"> 8。 Anapは、272.3g / molの分子量を有する環境に敏感なフルオロフォアであり、トリプトファン12 （ 図1A、1B ）よりわずかに大きいだけである。そのサイズが小さいため、リンカーを介して結合した従来のフルオロフォア（典型的には500g / mol超）と比較して、フルオロフォアによって導入される可能性のある立体効果はより少ない。さらに、Anapの場合、フルオロフォアはシステインに連結されたものよりもタンパク質骨格の近くに位置し、その結果、Anapはより局在化した再配列をプロービングしている。最後に、従来のVCFにおける内在性システインの除去は、UAA-VCFではもはや必須ではなく、したがって（i）タンパク質を（ほとんど）それらの天然状態にし、（ii）VCFを適用させる機能がシステイン置換によって改変され得るより広い範囲のタンパク質を研究する。
<img alt="図1" src = "/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg" />
図1 ：アナプスおよび蛍光スペクトル。 （ A ）Anapの化学構造。 （ B ）1nMのAnapに対する標準化された吸収スペクトルおよび発光スペクトル。これは、Anap蛍光の溶媒疎水性に対する感受性を実証する。発光スペクトルは、350nmで励起することによって得られた。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
蛍光UAAを使用することの欠点は、アミノアシル化tRNAの量が不足している場合、タンパク質の異種集団が停止コドンのリードスルー、翻訳再開、C末端トランケートタンパク質または内因性アミノアシル化とのクロストークに起因し得ることである。このようなリーク表現は、fUAAとtRNA / tRNAシンテターゼの対が存在しない場合には常にチェックする必要があります。トランスの問題に取り組んだ以前にN末端挿入部位のためにそれを回避する方法を提供する。しかしながら、fUAA、tRNAおよびtRNAシンテターゼが飽和量で存在する場合、漏出発現の可能性は低いままである。
fUAA-VCFと従来のVCFとの主要な手順の違いは、卵母細胞の注入および取り扱いである。 tRNAおよびtRNAシンテターゼ（pAnap）をコードするDNAの注入に続いて、タンパク質mRNAと同時注入されるか、またはインキュベーション溶液にアセトキシメチル（AM）エステルとして添加される、Anapの導入が続く。
Protocol
Representative Results
Discussion
tRNA-シンテターゼと共に連続的に転写されるtRNAのin vivoアミノアシル化は、蛍光測定のための高発現レベルを得ることを可能にする。効率的なfUAA取り込みのためには、pAnapが核内に正確に注入されることが重要である。核の正確な位置の不確定性のために、DNA注射の10〜40％が失敗すると予想され、非発現（または漏出発現）卵母細胞が生じる。したがって、AnapとpAnapの非存在下で発現?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pAnapはPeter Schultz博士（Scripps Research Institute）からの贈り物でした。この研究は、カナダ保健研究助成金MOP-102689とMOP-136894（RBへ）とカナダ財団法人イノベーショングラント950-225005によって資金提供されました。
Materials
| Solutions | |||
| Barth's solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 90mM |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 3mM |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-9397 | 0.82mM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C-7902 | 0.41mM |
| Ca(NO3)2 | Sigma-Aldrich | C-1396 | 0.33mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5mM |
| NaOH hydrate | BDH | BDH7225-4 | pH 7.6 |
| Penicilin | Invitrogen | 15140122 | 100U/mL |
| Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | 100µg/mL |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160054 | 10mg/100mL |
| Horse serum | Invitrogen | 16050122 | 5% |
| SOS Standard Oocyte Solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | 102 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | 3 mM |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | 1 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| External recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Internal recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Labeling solution | |||
| KOH | Fisher Scientific | P250-1 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| TMR stock solution | |||
| Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) | Molcular Probes by Life Technologies | T6027 | 5mM in DMSO |
| Anap stock solution | |||
| Anap | ABZENA (TCRS) | Custom synthesis TCRS-170 | 1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| pAnap | Addgene | 48696 | |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan Corporation | CA-1B | |
| Gpatch Acquisition software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Analysis software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Recording Chamber | Custom machined | ||
| Photo diode detection system | Dagan Corporation | PhotoMax-200/PIN | |
| Electrical shutter driver | UNIBLITZ | VCM-D1 | |
References
- Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).
- Xiao, H., Schultz, P. G. At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).
- Blunck, R. Chapter 9. Handbook of Ion Channels. , 113-133 (2015).
- Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
- DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides. J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane. J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).
- Haddad, G. A., Blunck, R. Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain. J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).
- Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels. J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).
- Kusch, J., et al. How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels. Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).
- Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
- Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids. Sci Rep. 5, 11866 (2015).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).
- Beckert, B., Masquida, B. Synthesis of RNA by in vitro transcription. Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).
- Goldin, A. L. Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection. Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).
- Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Zhao, J., Blunck, R. The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel. Elife. 5, (2016).
- Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer. Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).
- Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement. Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).
- Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).
- Baker, B. J., et al. Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).
- Miranda, P., et al. State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids. Methods. 36 (3), 270-278 (2005).
- Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins. Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).
