Spannklemme Fluorometrie in<em> Xenopus</em> Oozyten mit fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäuren
Summary
Dieser Artikel beschreibt eine Verbesserung der konventionellen Voltage-Clamp Fluorometry (VCF), bei der fluoreszierende unnatürliche Aminosäuren (fUAA) anstelle von Maleinimidfarbstoffen verwendet werden, um strukturelle Umlagerungen in Ionenkanälen zu untersuchen. Das Verfahren umfasst Xenopus- Oozyten-DNA-Injektion, RNA / fUAA-Coinjektion und gleichzeitige Strom- und Fluoreszenzmessungen.
Abstract
Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) war die Technik der Wahl, um die Struktur und die Funktion von elektrogenen Membranproteinen zu untersuchen, bei denen Echtzeitmessungen von Fluoreszenz und Strömen gleichzeitig über lokale Umlagerungen und globale Funktion berichten. Während hochauflösende Strukturtechniken wie Kryo-Elektronenmikroskopie oder Röntgenkristallographie statische Bilder der interessierenden Proteine liefern, liefert VCF dynamische Strukturdaten, die es uns ermöglichen, die strukturellen Umlagerungen (Fluoreszenz) mit dynamischen Funktionsdaten (Elektrophysiologie) zu verknüpfen. Bis vor kurzem beschränkte die Thiol-reaktive Chemie, die für die ortsgerichtete fluoreszierende Markierung der Proteine verwendet wurde, den Anwendungsbereich des Ansatzes, da alle zugänglichen Cysteine, einschließlich endogener, markiert werden. Es war also erforderlich, Proteine aus endogenen Cysteinen zu konstruieren. Die Etikettierung war auch auf Websites beschränkt, die von der extrazellulären zugänglich warenSeite. Dies änderte sich mit der Verwendung von fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäuren (fUAA), um spezifisch eine kleine fluoreszierende Sonde als Reaktion auf die Stop-Codon-Suppression unter Verwendung eines orthogonalen tRNA- und tRNA-Synthetasepaar 2 zu integrieren. Die VCF-Verbesserung erfordert nur ein zweistufiges Injektionsverfahren der DNA-Injektion (tRNA / Synthetase-Paar), gefolgt von einer RNA / fUAA-Co-Injektion. Nun ist die Etikettierung sowohl intrazellulärer als auch begrabener Standorte möglich, und die Verwendung von VCF hat sich erheblich erweitert. Die VCF-Technik wird dadurch attraktiv für das Studium einer breiten Palette von Proteinen und – noch wichtiger – ermöglicht die Untersuchung zahlreicher zytosolischer Regulationsmechanismen.
Introduction
Über 200 unnatürliche Aminosäuren verschiedener chemischer und physikalischer Eigenschaften wurden in Proteine in E. coli , Hefe und Säugetierzellen genetisch eingearbeitet 3 . Die unnatürliche Aminosäure wird als Reaktion auf ein spezifisches Stopcodon über ein orthogonal konstruiertes tRNA / Synthetasepaar eingebaut. Der genetische Ansatz zur Veränderung von Proteinen hat wertvolle Einblicke in die Proteinstruktur und -funktion gegeben. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verwendung von Spannungs-Klammer-Fluorometrie (VCF) in Kombination mit einer fluoreszierenden UAA vor.
In VCF ermöglicht die gleichzeitige Beobachtung von Funktionsdaten und strukturellen Umordnungen, die um die Fluoreszenzsonde (~ 5 Å) lokalisiert sind, eine dynamische Information mit Millisekundenauflösung 1 zu erhalten. Die fluoreszierenden Sonden verändern ihren Abschreckzustand bei lokalisierter Bewegung des Proteins. Eine Bewegung von nur 1-2 Å reicht aus, um zu signifikanten Veränderungen in der Fluoreszenz zu führenIntensität 4 Nach der Identifizierung der interessanten Stelle im Zielprotein wird die Stelle durch Punktmutation mutiert. Klassisch war der Rest zu einem Cystein mutiert worden, während jetzt ein Bernstein-Stop-Codon (TAG) für den genetischen fUAA-Einbau eingeführt wird. Das Protein wird dann in vitro transkribiert.
Während andere Expressionssysteme ( z. B. Säugetierzellen) 5 , 6 , 7 verwendet werden können, sind Xenopus- Oozyten aufgrund ihrer größeren Größe für Strukturfunktionsstudien vorzuziehen, was zu einer leichteren Manipulation und einer höheren Fluoreszenzintensität (mehr Fluorophoren) führt, Zu-Rausch-Verhältnis Darüber hinaus haben Xenopus- Oozyten einen geringen Hintergrund aus endogenen Proteinen 2 , 8 , und die dunkle Pigmentierung auf dem Tierpol schützt vor der Hintergrundfluoreszenz von tEr zytosol Die Xenopus- Oozyten werden chirurgisch entfernt und DNA, die für das für die fUAA spezifische orthogonale tRNA / tRNA-Synthetase-Paar kodiert, wird in den Kern der Oozyten injiziert. Nach einer 6-24 h Inkubationszeit wird die Protein-RNA mit dem fUAA in das Cytosol der Oozyten co-injiziert, gefolgt von einer 2-3-tägigen Inkubationszeit. Um eine Beschädigung der fUAA (Photobleichung) zu verhindern, müssen die Verfahren einschließlich Anap unter rotem Licht durchgeführt werden, um eine Fluorophor-Erregung zu vermeiden.
Oozyten werden auf einem aufgeschnittenen Oozytenspannungsklemmenaufbau untersucht, der auf einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop montiert ist und elektrische Strom- und Fluoreszenzänderungen gleichzeitig aufgezeichnet werden 9 , 10 . Alternativ können zwei Elektrodenspannungsklemmen 1 oder Patch-Clamp-Konfigurationen 11 verwendet werden. Die Fluoreszenz wird durch entsprechende Wellenlängen mit niedrigem RMS-Rauschen angeregt Emission, die unter Verwendung einer Photodiode aufgezeichnet wurde, die mit einem Verstärker mit hoher Verstärkung verbunden ist.
Es gibt mehrere Vorteile der Verwendung von fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäuren (fUAAs) in der Spannungskammer-Fluorometrie. Einer ist Zugang zur cytosolischen Seite der Membranproteine; Hier befinden sich viele regulatorische Prozesse ( zB Ca 2+ – oder Nukleotidbindungsstellen, schnelle und geschlossene Inaktivierung von spannungsgesteuerten Ionenkanälen, Porenöffnung, Modulkopplung). Alle diese Prozesse sind nun für die fluoreszierende Markierung zugänglich.
Ein weiterer Vorteil ist die geringe Größe der Sonde, die zu einer geringeren Störung des Proteins führt. Bisher wurden zwei orthogonale tRNA / tRNA-Synthetasepaare für fUAAs 12 , 13 entwickelt, wobei 3- (6-Acetylnaphthalin-2-ylamino) -2-aminopropansäure (Anap) die einzige FUAA ist, die in Xenopus- Oozyten verwendet wurde 2 ,"Xref"> 8 Anap ist ein umweltfreundlicher Fluorophor mit einem Molekulargewicht von 272,3 g / mol und ist nur etwas größer als Tryptophan 12 ( Fig. 1A, 1B ). Aufgrund ihrer geringen Größe werden wahrscheinlich weniger sterische Effekte durch das Fluorophor eingeführt, verglichen mit herkömmlichen Fluorophoren, die über einen Linker (typischerweise mehr als 500 g / mol) befestigt sind. Darüber hinaus befindet sich im Falle von Anap das Fluorophor näher an dem Proteinrückgrat als die an Cysteine gebundenen, und folglich untersucht Anap mehr lokalisierte Umlagerungen. Schließlich ist die Entfernung von endogenen Cysteinen in konventionellem VCF, um eine ortsspezifische Markierung zu gewährleisten, in UAA-VCF nicht mehr erforderlich und verlässt daher (i) die Proteine in (fast) ihrem nativen Zustand und (ii) erlaubt es, VCF anzuwenden Um eine breitere Palette von Proteinen zu untersuchen, in denen die Funktion durch Cysteinsubstitution verändert werden kann.
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Abbildung 1 : Anap- und Fluoreszenz-Spektren. ( A ) Chemische Struktur von Anap. ( B ) Normalisiertes Absorptionsspektrum und Emissionsspektren für 1 nM Anap, was die Empfindlichkeit der Anap-Fluoreszenz gegenüber der Lösungsmittel-Hydrophobie zeigt. Emissionsspektren wurden durch Anregung bei 350 nm erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Ein Nachteil bei der Verwendung von fluoreszierenden UAAs besteht darin, dass eine heterogene Population von Proteinen aus der Stop-Codon-Durchlesung, der Translationsneubinierung, den C-terminalen trunkierten Proteinen oder dem Übersprechen mit endogener Aminoacylierung resultieren kann, wenn die Menge an aminoacylierten tRNAs knapp ist. Solche Leck-Expression sollte immer in Abwesenheit von fUAA und dem tRNA / tRNA-Synthetase-Paar überprüft werden. Wir haben uns mit der Frage befasstLationaler Reinitiation und deren Umgehung für N-terminale Einführungsstellen zuvor 14 . Wenn jedoch die fUAA-, tRNA- und tRNA-Synthetase in gesättigten Mengen vorliegen, bleibt nur eine geringe Wahrscheinlichkeit der Leck-Expression bestehen.
Der wesentliche prozedurale Unterschied zwischen fUAA-VCF und konventionellem VCF ist die Injektion und Handhabung der Oozyten; Die Injektion von DNA, die für die tRNA und die tRNA-Synthetase (pAnap) kodiert, folgt der Einführung von Anap, die entweder mit der Protein-mRNA co-injiziert wird oder alternativ der Inkubationslösung als Acetoxymethyl (AM) -ester zugesetzt wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in vivo- Aminoacylierung von tRNAs, die kontinuierlich zusammen mit der tRNA-Synthetase transkribiert werden, ermöglicht es, hohe Expressionsniveaus für Fluoreszenzmessungen zu erhalten. Für eine effiziente fUAA-Inkorporation ist es entscheidend, dass pAnap korrekt in den Zellkern injiziert wird. Aufgrund der Ungewissheit der genauen Lage des Kerns wird erwartet, dass 10-40% der DNA-Injektionen versagen, was zu nicht-exprimierenden (oder leckexprimierenden) Oozyten führt. Daher ist es wichtig, den Ausdr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PAnap war ein freundliches Geschenk von Dr. Peter Schultz (Scripps Research Institute). Diese Arbeit wurde von den kanadischen Instituten für Gesundheitsforschungsstipendien MOP-102689 und MOP-136894 (an RB) und der kanadischen Stiftung für Innovation Grant 950-225005 finanziert.
Materials
| Solutions | |||
| Barth's solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 90mM |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 3mM |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-9397 | 0.82mM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C-7902 | 0.41mM |
| Ca(NO3)2 | Sigma-Aldrich | C-1396 | 0.33mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5mM |
| NaOH hydrate | BDH | BDH7225-4 | pH 7.6 |
| Penicilin | Invitrogen | 15140122 | 100U/mL |
| Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | 100µg/mL |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160054 | 10mg/100mL |
| Horse serum | Invitrogen | 16050122 | 5% |
| SOS Standard Oocyte Solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | 102 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | 3 mM |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | 1 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| External recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Internal recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Labeling solution | |||
| KOH | Fisher Scientific | P250-1 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| TMR stock solution | |||
| Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) | Molcular Probes by Life Technologies | T6027 | 5mM in DMSO |
| Anap stock solution | |||
| Anap | ABZENA (TCRS) | Custom synthesis TCRS-170 | 1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| pAnap | Addgene | 48696 | |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan Corporation | CA-1B | |
| Gpatch Acquisition software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Analysis software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Recording Chamber | Custom machined | ||
| Photo diode detection system | Dagan Corporation | PhotoMax-200/PIN | |
| Electrical shutter driver | UNIBLITZ | VCM-D1 | |
References
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