الجهد المشبك فلوروميتري في<em> القيطم</em> البويضات باستخدام الفلورسنت الأحماض الأمينية غير طبيعية
Summary
توضح هذه المقالة تعزيز التقليدية الجهد المشبك فلوروميتري (فف) حيث يتم استخدام الفلورسنت الأحماض الأمينية غير طبيعية (فوا) بدلا من الأصباغ ماليميد، لتحقيق إعادة ترتيب الهيكلي في القنوات الأيونية. ويشمل الإجراء زينوبوس البويضات حقن الحمض النووي، رنا / فوا سوينجكتيون، والقياسات الحالية والضوضاء في وقت واحد.
Abstract
وكان الجهد المشبك فلوروميتري (فف) تقنية الاختيار للتحقيق في هيكل ووظيفة البروتينات الغشاء الإلكتروجيني حيث القياسات في الوقت الحقيقي من مضان والتيارات تقرير في وقت واحد على إعادة ترتيب المحلية والوظيفة العالمية، على التوالي 1 . في حين أن تقنيات عالية الدقة الهيكلية مثل المجهر الإلكتروني البرد أو الأشعة السينية البلورات توفر صور ثابتة للبروتينات من الفائدة، فف يوفر البيانات الهيكلية الديناميكية التي تسمح لنا لربط إعادة الهيكلة الهيكلية (مضان) لبيانات وظيفية ديناميكية (الكهربية). حتى وقت قريب، والكيمياء ثيول رد الفعل المستخدمة في وضع العلامات الموجهة فلورزنت الموقع من البروتينات يقيد نطاق النهج لأنه سيتم وصفها جميع سيستينس الوصول إليها، بما في ذلك الذاتية. وبالتالي كان مطلوبا لبناء البروتينات خالية من السيستين الذاتية. كما تم وضع العلامات على المواقع التي يمكن الوصول إليها من خارج الخليةجانب. هذا تغير مع استخدام الفلورسنت الأحماض الأمينية غير طبيعية (فوا) لدمج على وجه التحديد مسبار الفلورسنت الصغيرة ردا على وقف قمع الكودون باستخدام الحمض الريبي النووي النقال متعامد ورنا الحمض الريبي النووي النقال سينثيتاس 2 . تحسين فف يتطلب فقط إجراء حقن من خطوتين من حقن الحمض النووي (الحمض الريبي النووي النقال / زوج سينثيتاس) تليها الحمض النووي الريبي / فوا شارك في الحقن. الآن، وضع العلامات على كل من الخلايا والمواقع المدفونة ممكن، واستخدام فف توسعت بشكل كبير. وبالتالي فإن تقنية فف تصبح جذابة لدراسة مجموعة واسعة من البروتينات، والأهم من ذلك – يسمح التحقيق في العديد من الآليات التنظيمية عصاري خلوي.
Introduction
وقد تم دمج أكثر من 200 من الأحماض الأمينية غير الطبيعية من مختلف الخصائص الكيميائية والفيزيائية وراثيا في البروتينات في E. القولونية والخميرة وخلايا الثدييات 3 . يتم تضمين الأحماض الأمينية غير الطبيعية ردا على كودون وقف معين عن طريق زوج متعامد المهندسة الحمض الريبي النووي النقال / سينثيتاس. وقد وفرت النهج الوراثي لتعديل البروتينات رؤى قيمة في هيكل البروتين وظيفة. هنا، نقدم بروتوكول لاستخدام الجهد المشبك فلوروميتري (فف) في تركيبة مع وا الفلورسنت.
في فف، ومراقبة في وقت واحد من البيانات الوظيفية وإعادة الهيكلة الهيكلي المترجمة حول مسبار الفلورسنت (~ 5 Å) يسمح لنا للحصول على معلومات ديناميكية مع ميلي ثانية واحدة القرار 1 . تحقيقات الفلورسنت تغير حالة التبريد الخاصة بهم على حركة محلية من البروتين. حركة فقط 1-2 Å كافية تؤدي إلى تغييرات كبيرة في مضانكثافة 4 . بعد تحديد موقع الفائدة في البروتين المستهدف، يتم تحور الموقع عن طريق طفرة نقطة. بشكل كلاسيكي، تم تحوير بقايا إلى السيستين في حين الآن، يتم إدخال كودون وقف العنبر (تاج) لدمج فوا الوراثية. ثم يتم في البروتين المختبر كتب في المختبر .
في حين أن أنظمة التعبير الأخرى (على سبيل المثال، خلايا الثدييات) يمكن استخدامها 5 ، 6 ، 7 ، والبويضات القيطم هي الأفضل للدراسات هيكل وظيفة بسبب حجمها أكبر، مما يؤدي إلى التلاعب أسهل وكثافة أعلى مضان (أكثر فلوروفوريس)، وبالتالي، إلى نسبة الضوضاء. وعلاوة على ذلك، البويضات القيطم لها خلفية منخفضة من البروتينات الذاتية 2 ، 8 ، والتصبغ الظلام على الدروع القطب الحيواني ضد مضان الخلفية من رانه سايتوسول. يتم إزالة البويضات القيطم جراحيا ويتم حقن الحمض النووي ترميز الحمض الريبي النووي النقال متعامد / الحمض الريبي النووي النقال-سينثيتاس محددة ل فوا في نواة البويضات. بعد 6-24 ساعة ساعة الحضانة، يتم حقن الحمض النووي الريبي البروتين مع فوا في السيتوسول من البويضات، تليها فترة الحضانة 2-3 أيام. من أجل منع أي ضرر على فوا (فوتوبلاشينغ)، والإجراءات بما في ذلك أناب يجب أن تنفذ تحت الضوء الأحمر لتجنب فلورفور الإثارة.
يتم دراسة البويضات على قطع مفتوحة البويضة الجهد المشبك الإعداد، والتي هي التي شنت على المجهر مضان تستقيم، وتسجيل التيار الكهربائي والتغيرات مضان في وقت واحد 9 ، 10 . بدلا من ذلك، اثنين من القطب الكهربائي المشبك الجهد 1 أو التصحيح المشبك تكوينات 11 يمكن استخدامها. مضان هو متحمس من قبل الأطوال الموجية المناسبة مع انخفاض الضوضاء رمز و الانبعاثات المسجلة باستخدام الثنائي الضوئي مرتبطة مكبر للصوت مع التضخيم عالية.
هناك العديد من المزايا من استخدام الفلورسنت الأحماض الأمينية غير طبيعية (فواس) في فلوريوميتري الجهد المشبك. واحد هو الوصول إلى الجانب عصاري خلوي من البروتينات الغشاء. وتقع العديد من العمليات التنظيمية هنا (على سبيل المثال، كا 2 + – أو المواقع النوكليوتيدات ملزمة، سريع وإغلاق الدولة تعطيل قنوات أيون الجهد بوابات، افتتاح المسام، اقتران وحدة). كل هذه العمليات يمكن الوصول إليها الآن لوضع العلامات الفلورسنت.
ميزة أخرى هي صغر حجم التحقيق مما يؤدي إلى أقل اضطراب في البروتين. حتى الآن، تم تصميم اثنين من أزواج الحمض الريبي النووي النقال / ترنا سينثيتاس متعامد ل فواس 12 ، 13 ، حيث 3- (6-أسيتيلنافثالين 2-يلامينو) -2-أمينوبروبانويك حمض (أناب) هو فوا الوحيد الذي تم استخدامه في البويضات القيطم 2 ،"كريف"> 8. أناب هو فلوروفور حساسة بيئيا مع الوزن الجزيئي من 272.3 ز / مول وهي أكبر قليلا فقط من التربتوفان 12 ( أرقام 1A، 1B ). نظرا لصغر حجمها، من المرجح أن يتم إدخال عدد أقل من التأثيرات المجسمة بواسطة الفلورفور مقارنة مع الفلوروفوريس التقليدي المرفق عبر رابط (عادة أكثر من 500 جم / مول). وعلاوة على ذلك، في حالة أناب، ويقع فلورفور أقرب إلى العمود الفقري البروتين من تلك المرتبطة سيستينس، وبالتالي، أناب هو البحث عن إعادة ترتيب أكثر محلية. وأخيرا، إزالة السيستين الذاتية في فف التقليدية من أجل ضمان وضع العلامات على الموقع لم يعد شرطا في وا-فف وبالتالي (1) يترك البروتينات في (تقريبا) حالتهم الأصلية و (إي) يسمح فف ليتم تطبيقها لدراسة مجموعة واسعة من البروتينات التي يمكن تغيير وظيفة من خلال استبدال السيستين.
<img alt="شكل 1" src = "/ فيليز / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg" />
الشكل 1 : أناب و مضان الأطياف. ( A ) التركيب الكيميائي لل أناب. ( B ) طيف الامتصاص تطبيع وأطياف الانبعاثات ل 1 نانومتر أناب، مما يدل على حساسية مضان أناب إلى مسعور المائي. تم الحصول على أطياف الانبعاث مثيرة في 350 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
العيب من استخدام وارس الفلورسنت هو أن السكان غير المتجانسة من البروتينات قد ينتج عن وقف كودون ريدثرو، إعادة التأهيل متعدية، C- محطة اقتطاع البروتينات أو الحديث المتبادل مع أمينواسيلاتيون الذاتية إذا كان كمية ترناس أمينواسيلاتد نادرة. وينبغي دائما التحقق من هذا التعبير تسرب لفي غياب فوا ورنا الحمض الريبي النووي النقال / الحمض الريبي النووي النقال سينثيتاس الزوج. لقد تناولنا مسألة الانتقالوكيفية تكرارها، وكيفية التحايل عليها من أجل مواقع الإدراج N-ترمينال سابقا 14 . ومع ذلك، عندما فوا، ترنا و ترنا سينثيتاس موجودة في كميات مشبعة، لا يزال هناك احتمال ضئيل للتعبير تسرب.
الاختلاف الإجرائي الرئيسي بين فوا-فف و فف التقليدي هو الحقن والتعامل مع البويضات. حقن الحمض الريبي النووي النقال ترنا الحمض الريبي النووي النقال و ترنا سينثيتاس (باناب) يليه إدخال أناب، والتي هي إما شارك في حقن مع مرنا البروتين أو بدلا من ذلك إضافة إلى حل الحضانة كما استر أسيتوكسيميثيل (آم).
Protocol
Representative Results
Discussion
في أمينواسيلاتيون في الجسم الحي من ترناس التي يجري بشكل مستمر يجري نسخها جنبا إلى جنب مع الحمض الريبي النووي النقال-سينثيتاس، يجعل من الممكن الحصول على مستويات التعبير عالية لقياسات مضان. لدمج فوا كفاءة، فمن الأهمية بمكان أن يتم حقن باناب بشكل صحيح في النو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان باناب هدية نوع من الدكتور بيتر شولتز (معهد سكريبس للبحوث). وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لبحوث الصحة المنح موب-102689 و موب-136894 (إلى رب) والمؤسسة الكندية للابتكار منحة 950-225005.
Materials
| Solutions | |||
| Barth's solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 90mM |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 3mM |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-9397 | 0.82mM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C-7902 | 0.41mM |
| Ca(NO3)2 | Sigma-Aldrich | C-1396 | 0.33mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5mM |
| NaOH hydrate | BDH | BDH7225-4 | pH 7.6 |
| Penicilin | Invitrogen | 15140122 | 100U/mL |
| Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | 100µg/mL |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160054 | 10mg/100mL |
| Horse serum | Invitrogen | 16050122 | 5% |
| SOS Standard Oocyte Solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | 102 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | 3 mM |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | 1 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| External recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Internal recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Labeling solution | |||
| KOH | Fisher Scientific | P250-1 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| TMR stock solution | |||
| Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) | Molcular Probes by Life Technologies | T6027 | 5mM in DMSO |
| Anap stock solution | |||
| Anap | ABZENA (TCRS) | Custom synthesis TCRS-170 | 1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| pAnap | Addgene | 48696 | |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan Corporation | CA-1B | |
| Gpatch Acquisition software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Analysis software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Recording Chamber | Custom machined | ||
| Photo diode detection system | Dagan Corporation | PhotoMax-200/PIN | |
| Electrical shutter driver | UNIBLITZ | VCM-D1 | |
References
- Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).
- Xiao, H., Schultz, P. G. At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).
- Blunck, R. Chapter 9. Handbook of Ion Channels. , 113-133 (2015).
- Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
- DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides. J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane. J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).
- Haddad, G. A., Blunck, R. Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain. J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).
- Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels. J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).
- Kusch, J., et al. How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels. Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).
- Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
- Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids. Sci Rep. 5, 11866 (2015).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).
- Beckert, B., Masquida, B. Synthesis of RNA by in vitro transcription. Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).
- Goldin, A. L. Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection. Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).
- Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Zhao, J., Blunck, R. The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel. Elife. 5, (2016).
- Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer. Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).
- Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement. Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).
- Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).
- Baker, B. J., et al. Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).
- Miranda, P., et al. State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids. Methods. 36 (3), 270-278 (2005).
- Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins. Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).
