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Immunology and Infection

Un modello di ratto di occhi seccari autoimmuni cronici con un aumento delle cellule T di memoria di Effector in tessuto Eyeball

Published: June 07, 2017
doi:
10.3791/55592
, , ,
1Singapore Eye Research Insitute, A Member of SingHealth, 2DUKE-National University of Singapore Medical School, 3Lee Kong Chian School of Medicine,Nanyang Technological University, 4Singapore National Eye Center, 5Yong Loo Lin School of Medicine,National University of Singapore

Summary

Questo rapporto descrive un metodo per indurre l'occhio asciutto autoimmune cronico in Lewis ratti attraverso l'immunizzazione con un'emulsione di estratto di ghiandola lacrimale, ovalbumina e completo adiuvante di Freund, seguita dall'iniezione di estratto di ghiandola lacrimale e di ovalbumina nella subconjunctiva e nella ghiandola lacrimale fornicea Sei settimane dopo.

Abstract

La malattia dell'occhio secco è una condizione molto comune che causa la morbilità e l'onere della sanità e riduce la qualità della vita. C'è la necessità di un adeguato modello di animali a occhio secco per testare nuove terapie per curare le condizioni dell'occhio secco autoimmune. Questo protocollo descrive un modello cronico ratto autoimmune a secco. I ratti di Lewis sono stati immunizzati con un'emulsione contenente estratto della ghiandola lacrimale, ovalbumina e completo adiuvante di Freund. Una seconda immunizzazione con gli stessi antigeni nell'adjvant incompleto di Freund è stata somministrata due settimane dopo. Queste immunizzazioni sono state somministrate sottocutanea alla base della coda. Per aumentare la risposta immunitaria alla superficie oculare e alle ghiandole laceranti, l'estratto della ghiandola lacrimale e l'ovalbumina sono stati iniettati nella subconjunctiva e nella ghiandola lacrimale fornicea 6 settimane dopo la prima immunizzazione. I ratti hanno sviluppato caratteristiche dell'occhio secco, tra cui la riduzione della lacrima, la diminuzione della stabilità della lacerazione e un aumento del danno corneale. Immune proArchiviazione mediante citometria a flusso ha mostrato una preponderanza di CD3 + efficace memoria T cellule nel bulbo oculare.

Introduction

La malattia oculare secca (DED) è una malattia multifattoriale delle lacrime e della superficie oculare che provoca sintomi di disagio, disturbi visivi e instabilità del film della lacerazione, che possono portare a danni alla superficie oculare. È accompagnata da una maggiore osmolarità della pellicola di lacrima e da infiammazione della superficie oculare 1 . I sintomi associati a DED stanno bruciando, pungente, grinta, sensazione di corpo estraneo, strappo, stanchezza oculare e secchezza 2 , 3 . Le due cause principali di DED sono la riduzione della produzione di lacrima dalla ghiandola secrezione della lacrima e dall'eccessiva evaporazione della pellicola di lacrima 4 . Nei pazienti con malattie autoimmuni, come la sindrome di Sjogren, il lupus eritematoso sistemico e l'artrite reumatoide, il danno immunitario alle ghiandole meibomiche riduce l'espressione dei lipidi essenziali per la stabilità della lacerazione. Inoltre, il danno immunitario alla superficie oculare diminuisce i prodottiSu mucine importanti per la bagnabilità superficiale. Insieme, questi processi causano cumulativamente l'occhio secco cronico 5 , 6 , 7 .

La sostituzione di strappo e la terapia antinfiammatoria sono i pilastri della terapia. Tuttavia, le attuali terapie anti-infiammatorie per il DED ( cioè i corticosteroidi e la ciclosporina) sono generalmente immunosoppressivi, portando a gravi effetti negativi 8 , 9 , 10 . C'è bisogno di un modello animale adatto per testare nuovi agenti immunomodulatori per curare l'occhio secco autoimmune.

Mouse con difetti genetici specifici 11 , 12 , 13 , topi che non dispongono di geni specifici 14 , 15 e topi transgenici che sovrasta l'immunoregolazioneGeni ory sono stati usati come modelli di occhio secco autoimmune 16 , 17 . Sono stati riportati anche modelli animali autoimmuni indotti da antigene nei topi 18 , conigli 19 e ratti 20 , 21 . Qui descriviamo un modello antigenico indotto da occhio secco autoimmune cronico. Questo modello è una modifica di due modelli precedenti; Uno ha utilizzato estratti della ghiandola lacrimale e la seconda ha usato un autoantigene ( cioè, klk1b22) dalle ghiandole laceranti 20 , 21 .

La malattia è stata indotta dalla vaccinazione sottocutanea di 6 a 8 settimane di razza Lewis femminile con ovalbumina, adiuvante completo di Freund e un'emulsione contenente estratti della ghiandola lacrima dai ratti di Sprague-Dawley ( Figura 1 ). Una seconda immunizzazione con lo stesso antigene nell'additivo incompleto di Freund eraSomministrato due settimane dopo. Per reclutare le cellule immunitarie specifiche di antigene alla ghiandola lacrimale e alla superficie oculare, la mescolanza di estratto della ghiandola lacrimale e l'ovalbumina (1 mg / ml) è stata iniettata nella subconjunctiva e nella ghiandola lacrimale fornicea alla 6 ° -7 ° settimana ( Figura 1 ). Più dell'85% dei ratti ha sviluppato caratteristiche caratteristiche dell'occhio secco 70 giorni dopo la prima immunizzazione. Queste caratteristiche includono la riduzione della produzione di lacrime ( Figura 2 ), una maggiore colorazione della fluoresceina corneale ( Figura 3 ) e una diminuzione della stabilità della lacerazione ( Figura 4 ). La profilazione immunitaria delle cellule T negli occhi degli ratti normali mediante citometria a flusso rivela una preponderanza delle cellule T di memoria CD3 + ( figure 5 e 6 ). I ratti con DED autoimmuni mostrano un aumento delle cellule T di memoria CD3 + e di una corrispondente diminuzione delle cellule T delle cellule naive e centrali ( Figura 6 </strong>).

Protocol

Gli animali sono stati trattati secondo le linee guida istituzionali e la dichiarazione ARVO per l'uso degli animali in ricerca oftalmica e visiva. Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di SingHealth. 1. Preparazione del Lacrimal Gland Extract NOTA: I ratti sono stati anestetizzati con l'iniezione intraperitoneale di ketamina (75 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). L'anestesia corretta è stata confermata dal pizzicamento del piede e dalla pinza di coda. Il gel oftalmico è stato applicato agli occhi del ratto per prevenire la secchezza dopo ogni procedura. I ratti anestetizzati sono stati messi sotto luci infrarosse lontane per mantenere gli animali caldi fino a quando sono completamente recuperati. Durante le procedure e il tempo di recupero, gli animali sono stati attentamente monitorati dai ricercatori. Tutti i materiali e gli strumenti per la chirurgia erano sterili prima dell'uso. Al termine dell'esperimento, i ratti sono stati eutanizzati dall'iniezione intraperitoneale di pentobarbital (80 mg / kg).L'eutanasia completa è stata verificata per mancanza di impulso cardiaco e nessun riflesso lampeggiante toccando il bulbo oculare. I ratti sono stati alloggiati in condizioni standard: temperatura ambiente, 21-23 ° C; Umidità relativa, 30-70%; Ciclo chiaro e scuro, alternato a 12 h (7: 00-19: 00). Posizionare i ratti femminili Sprague-Dawley eutanizzati (fascia d'età da 8 settimane a 16 settimane) piatti, con un orecchio contro il tavolo e l'altro rivolto verso l'alto. Effettuare un'incisione di 10 mm superiore-inferiormente sotto l'orecchio esposto con una coppia di forbici a molla. Rimuovere la ghiandola lacrima disseattendola dal tessuto connettivo circostante e dal condotto di drenaggio. Conservare le ghiandole a -80 ° C fino a quando necessario. Sciogli le ghiandole sul ghiaccio. Mince il più finemente possibile su ghiaccio con forbici. Aggiungere 150 μl di PBS con 1x inibitore della proteasi per ghiandola lacrimale. Sonicare i campioni su ghiaccio per 5 minuti a 20 kHz con il sonicatore impostato a 10 s in on, 10 s fuori con l'ampiezza del 30%. Centrifugare il figlioPer 20 minuti a 13.000 xg e 4 ° C. Pipettare il surnatante e trasferirlo in un nuovo tubo. Aliquota il supernatante fino a 1,5 ml di tubi e conservarli a -80 ° C. Misurare la concentrazione proteica con un dosaggio acido bicinconico 22 , come da istruzioni del produttore. 2. Preparazione dell'emulsione e della tosse della puteria Emulsione Aggiungere 40 mg di caldo ucciso Mycobacterium tuberculosis H37Ra in 10 ml di adiuvante completo di Freund contenente 1 mg / mL di Mycobacterium tuberculosis H37Ra e mescolare bene. NOTA: L' adiuvante finale completo di Freund contiene 5 mg / mL di Mycobacterium tuberculosis H37Ra. Pesare l'ovalbumina, sciogliere in PBS e preparare una miscela antigene contenente 2 mg / ml di ovalbumina e 10 mg / ml estratto di ghiandola lacrimale. Puntando per un volume di iniezione di 200 μL per ogni animale, preparare una miscela master bAsati sui numeri animali. Trasferire l'incompleto adiuvante di Freund o completare l'adiuvante di Freund a un tubo da 50 mL, assicurando che il volume di adiuvante alla miscela antigene sia in rapporto 1: 1. Aggiungere la miscela antigene a goccia-goccia all'adjuvant mentre vortice con la massima velocità che non provoca versamenti. Continuare a vortexare per 5 minuti dopo che tutto l'antigene è stato aggiunto. Trasferire l'emulsione in una siringa da 5 ml e collegarla con un'altra siringa da 5 ml attraverso un connettore a siringa. Spingere l'emulsione da una siringa all'altra per mescolarla. NOTA: L'emulsione è pronta se una singola gocce rimane come sfera quando viene posta in acqua. Deve essere utilizzato solo emulsione o emulsione appena preparata conservata durante la notte a 4 ° C. Tossina della puteria Ricostituire 50 μg di tossina pertussica in 500 μl di acqua per ottenere una concentrazione finale di 100 ng / μL. Votex il contenitore per 30 s per assicurarsi che il tOssina si dissolve completamente. NOTA: Non sterilizzare per filtrazione, in quanto ciò provocherà una perdita di materiale. Non congelare. Questa soluzione rimane attiva per almeno 6 mesi a 4 ° C. Diluire 100 ng / μL di tossina pertussica a 3 ng / μL usando PBS. Trasferire 100 μL della tossina pertussica diluita in una siringa di iniezione Luer-lock da 1 ml con un ago da 27 G. 3. Immunizzazione dei ratti di Lewis Il giorno 0, mescolare l'emulsione poche volte. Distribuire 200 μL dell'emulsione contenente 1 mg di estratto della ghiandola lacrimale e 200 μg di ovalbumina nell'adjvant completo di Freund, in 1 ml di siringhe Luer-lock con aghi da 27G. Iniettare l'emulsione sottocutanea alla base delle code del ratto senza anestesia. NOTA: la coda non deve essere pre-riscaldata prima dell'iniezione. Ogni ratto viene immunizzato con 1 mg di estratto della ghiandola lacrimale e 200 μg di ovalbumina nel completo complemento di FreundH 500 μg di Mycobacterium tuberculosis H37Ra. Il giorno 14, iniettare 200 μL dell'emulsione, che contiene 1 mg di estratto della ghiandola lacrimale e 200 μg di ovalbumina in un incompleto adiuvante di Freund, nello stesso modo del giorno 0. Iniettare 300 ng di tossina pertussica in 100 μL di PBS intraperitonealmente Per ratto nello stesso giorno. 4. Iniezione della Miscela Antigenica nella Subconjunctiva Fornicaria e Lacrimal Gland per reclutare cellule immunitarie specifiche antigene e causare l'infiammazione locale Calcolare la quantità di estratto di ovalbumina e ghiandola lacrimale basata sul numero di ratti nell'esperimento. Pesare la quantità richiesta di ovalbumina e combinarla con l'estratto di ghiandola lacrimale sbrinato preparato nel passaggio 1, facendo una soluzione antigene contenente 1 mg / ml di ovalbumina e 1 mg / ml estratto di ghiandola lacrimale. Anestetizzare i ratti con ketamina (75 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) mediante iniezione intraperitoneale. Pinch the toEs di ratti per assicurare che sia stata raggiunta una corretta anestesia ( cioè, non si osserva alcun movimento sensibile dopo il pizzico). Iniettare 5 μL di antigene nella sottoconjunctiva del forniceal dell'occhio. Iniettare 20 μL di antigene nella ghiandola lacrimale. 5. Valutazione delle caratteristiche dell'occhio secco NOTA: Per i punti 5.1-5.3, i ratti anestetizzati devono essere tenuti delicatamente da una mano guantata in posizione verticale su una superficie piana per evitare il movimento. Misurare il volume di strappo con filo rosso fenolo. Utilizzare una coppia di pinze per tenere il filo e un altro per tirare la palpebra inferiore del ratto. Mettere il filo all'angolo prossimale della fornix inferiore per 1 min e quindi rimuovere il filo. NOTA: le lacrime rendono la parte umida del filo rosso in colore. Prendi un'immagine della lunghezza della parte umida del filo accanto a un righello con marcature millimetriche. Misura la lunghezza bagnata fino alla decima oMillimetro fa utilizzando un software di immagine ( ad esempio, ImageJ). Misura cornea / liscia lacerazione. Posizionare il topo sotto uno stereomicroscopio dotato di un illuminatore a sfera e di una telecamera. Applicare 5 μL di salina alla cornea del ratto. Passi in modo passivo muovendo le palpebre superiore e inferiore con le dita guantate ~ 5 volte per diffondere la soluzione salina. Mettete a fuoco l'illuminatore dell'anello in mezzo alla superficie della cornea con ingrandimento 1,6x. Acquisisci immagini fotografiche dopo 10 s. NOTA: L'illuminatore dell'anello proietta due file circolari di punti sulle cornee dell'animale. La spaziatura regolare dei punti indistinti suggerisce un liscio strato di cornea / lacrima. Misurare i danni corneali con la colorazione fluoresceina. Aggiungere 2 μL di fluoresceina allo 0,2% alla cornea del ratto. Aprire e chiudere passivamente le palpebre del topo 3 volte con un dito guantato per diffondere la colorazione fluoresceina sulla superficie dell'occhio. <lI> Dopo 1 min, disegnare 1 ml di soluzione salina con una siringa da 3 ml (senza attacco ad aghi), posizionare la siringa di circa 2-3 mm anteriore alla cornea e spingerla delicatamente sulla soluzione salina sull'occhio. Acquisisci immagini sotto il filtro blu cobalto ( cioè ~ 400 nm) di un microscopio ocular-imaging con le luci di sfondo spenti. NOTA: le immagini sono state successivamente analizzate con un sistema di classificazione modificato dalle pubblicazioni precedenti 23 . Le immagini sono state quindi analizzate classificando soggettivamente il numero, l'area e l'intensità dei punti verdi da 0 a 2, dove 0 indica la loro assenza, 1 indica la colorazione punctata di meno di 50 punti e 2 indica la colorazione punctata di più di 50 punti. Eutanizzare i ratti attraverso l'iniezione intraperitoneale di pentobarbital (80 mg / kg). Rimuovere le palpebre superiore e inferiore con forbici. Fissare e prolasciare i bulbi oculari spingendo giù sui tessuti periocular con le pinze. Liberare il globo tagliando tI muscoli extraoculari, il nervo ottico e la congiuntiva fornicea. Fissare la posizione del bulbo oculare del ratto con le pinze e aprirlo con un'incisione circonferenziale lungo l'equatore. Rimuovere l'obiettivo e la vetreria. Mettete i bulbi oculari disseminati in tubi da 1,5 ml su ghiaccio. Raccogli le ghiandole lacrimali, come descritto nel punto 1.1. Trasferire immediatamente i tessuti del bulbo o le ghiandole laceranti al laboratorio per preparare l'analisi della citometria a flusso. Isolati le cellule immunitarie con collagenasi e disperdono i metodi di digestione II 24 , 25 . Procedere per utilizzare la citometria di flusso per profilare la sottopopolazione delle cellule T nei tessuti del bulbo oculare 26 . NOTA: Il pannello degli anticorpi è: anti-CD45APC-Cyanine7 (OX-1), anti-CD3 BV421 (1F4), anti-CD4 PE-Cyanine7 (OX-35), anti- CD45RC Alexa647 (OX-22) -CD62 PE (HRL1), anti-CD44 FITC (OX-50) e colorazione cellulare 7-AAD. Tra i CD45 + CD3 <sup> + 7AAD – la popolazione, naïve (CD3 + CD45RC + ), la memoria effettiva (T EM, CD3 + CD45RC – CD44 + CD62L-) e la memoria centrale (T CM, CD3 + CD45RC – CD44 + CD62L + .

Representative Results

La figura 1 illustra il disegno dell'esperimento. Il giorno 48 e il giorno 70, le caratteristiche cliniche dell'occhio secco sono valutate nei ratti immunizzati. Il volume di strappo è rappresentato dalla lunghezza della parte umida del filo rosso fenolo. La Figura 2 mostra immagini rappresentative di filetti di fenolo rosso dai controlli e dai ratti DED. La lunghezza dei fili rossi fenolici nel gruppo DED è più breve del gruppo di controllo, indicando meno volume di strappo. La fluoresceina si lega all'epitelio corneo danneggiato. Così, il danno corneale viene misurato mediante la colorazione delle corneali fluoresceine. Le macchie di fluoresceina sulla superficie corneale dei ratti DED sono state classificate da 0 a 2 e confrontate con i ratti di controllo. I ratti con DED hanno più macchie di fluoresceina rispetto ai ratti di controllo ( Figura 3 ), suggerendo danni corneali. La liscia corneaIn DED e nei ratti di controllo è stato valutato dall'illuminatore ad anello. Se la superficie corneale è liscia, con elevata stabilità della lacrima, l'immagine dell'anello illuminatore sulla superficie oculare è rotonda e perfetta. La distorsione dell'immagine indica una ridotta correttezza corneale e una pellicola di strappo instabile. Il grado di distorsione dell'anello è stato classificato da 0 a 2. Un livello di distorsione dell'anello maggiore è stato osservato nel gruppo DED ( Figura 4 ), indicando una stabilità della lacrima minore. I ratti sono definiti come occhio secco quando almeno due caratteristiche cliniche dell'occhio secco sono anomale. Tra i 24 ratti immunizzati, 21 ratti hanno sviluppato DED il giorno 48. I risultati sono stati coerenti quando valutati il ​​giorno 70. L'analisi della citometria a flusso dimostra che il sottomesso predominante di cellule T nei tessuti a base di ratto a raggi rotti è delle cellule T di memoria efficace ( Figura 5 ). Negli occhi del DED ratto, ~ 70% del CD3Le cellule T sono cellule T di memoria efficace, mentre nei ratti di controllo questo numero è ~ 50%. Le palpebre di DED ratti hanno cellule T di memoria efficace significativamente più elevate di quelle dei ratti di controllo ( Figura 6 ). Figura 1: Schema del disegno sperimentale. LG: ghiandola lacrima; DED: malattia dell'occhio secco; CFA: completa l'adiuvante di Freund; IFA: incompleto adiuvante di Freund. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Filetto rosso fenolico Misura il volume di strappo. Il filo rosso fenolico viene posto all'angolo prossimale di entrambi gli occhi di ratto per 1 min e viene quindi rimosso. RepresentativSono visualizzate le immagini del filo rosso fenolo, unitamente a un righello, da entrambi i gruppi di controllo e DED. ImageJ è stato utilizzato per misurare la lunghezza della parte umida dei fili rossi di fenolo. Barra di scala = 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Immagini rappresentative del danno epiteliale corneale misurato dalla colorazione fluoresceina. Ogni cornea del ratto è stata macchiata con fluoresceina 0,2% per 1 min e versata con almeno 1 ml di soluzione salina. Le immagini sono state scattate con un microscopio a occhio con luce blu cobalto. La prima colonna mostra immagini rappresentative delle cornee di controllo. La seconda colonna contiene immagini rappresentative della colorazione corneale da ratti con caratteristiche DED. I punti verdi fluorescenti indicano epiteli corneali L danno. Tutte le immagini sono state prodotte sulla stessa scala di colore. La quantificazione della colorazione dei fluoresceina è stata effettuata in base all'area e alla densità dei punti verdi. Barra di scala = 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Immagini rappresentative della cornea che mostrano la riflessione dell'illuminatore dell'anello. La corneale / rottura del ratto è stata misurata con un illuminatore a sfera. Il grado di distorsione dell'anello nelle immagini catturate è una misura della relativa stabilità della lacrima. La colonna a sinistra mostra le immagini rappresentative negli animali di controllo e la colonna a destra mostra immagini rappresentative dopo l'induzione dell'occhio secco. Barra di scala = 1 mm.Ank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Dot Plots derivati ​​dall'analisi della citometria di flusso. Le cellule T isolate dai tessuti del bulbo oculare sono state macchiate con un pannello di anticorpi. Nella popolazione CD45 + CD3 + 7AAD, le cellule CD3 + 7-AAD – T sono state guarite. Tra le cellule CD3 + 7-AAD – T, sono state determinate le popolazioni di nausea, memoria centrale e memoria effettiva T cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Profilo delle sottopopolazioni di cellule T nelle Eyeballs. CD3 + CD45RCLe cellule T delle cellule T, CD3 + CD45RC – CD44 + CD62L, e CD3 + CD45RC – CD44 + CD62L + sono state presentate come percentuale di cellule T di CD3 + . I risultati sono da 3 ratti di controllo e 6 ratti DED. Risultati simili sono stati ottenuti dall'analisi delle cellule T da ghiandole laceranti isolate (dati non mostrati). Il t-test di Student unpaired è stato utilizzato per il confronto statistico. Le barre di errore rappresentano la SD. * P <0,05, ** p <0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Una fase critica di questo protocollo è assicurare l'omogeneità dell'emulsione. Nelle emulsioni ben preparate, gli antigeni sono completamente ricoperti di olio, garantendo il lento rilascio dell'antigene iniettato e la stimolazione immunitaria continua. Un'altra caratteristica critica di questo protocollo è l'uso di ratti di Lewis. I ratti di Lewis sono più sensibili allo sviluppo della malattia autoimmune di altri ceppi 27 .

Questo protocollo è stato modificato da due protocolli precedentemente pubblicati, che utilizzavano esclusivamente l'estratto della ghiandola lacrimale o il ricombinante Klk1b22 20 , 21 . Nel protocollo attuale, l'estratto di ovalbumina e ghiandola lacrimale viene utilizzato come antigene e le cellule immunitarie specifiche per l'antigene vengono attratte dalla superficie oculare e dalla ghiandola lacrima, inducendo danni tissutali locali. L'occhio secco si sviluppa lentamente, raggiungendo l'85% al ​​giorno 48 dopo l'immunizzazione iniziale. Sfida antigenica alL'occhio e la ghiandola lacrima nel giorno 48 esacera l'occhio secco e assicura la sua cronicità fino al 70 ° giorno.

Rispetto al ricombinante Klk1b22 nel modello DED indotto da Klk, l'estratto della ghiandola lacrimale e l'ovalbumina utilizzati nel modello attuale sono più economici e più facili da ottenere. L'estratto della ghiandola lacrimale contiene anche altre proteine, oltre a Klk, che possono indurre autoimmunità, quindi questo estratto è teoricamente più potente del metodo di Klk a indurre DED. Abbiamo anche provato i ratti immunizzanti con estratto solo della ghiandola lacrimale; Sebbene questi ratti immunizzati sviluppassero DED, non c'era alcun aumento significativo delle cellule T di memoria efficace nei tessuti del bulbo oculare rispetto ai controlli.

La limitazione di questa tecnica è che occorrono 70 giorni per raggiungere il modello. Le cellule T di memoria dell'effettore sono le principali sottostazioni della cellula T nel normale occhio del ratto. In questo modello, il DED autoimmune produce un aumento delle cellule T di memoria CD3 + efficace nel bulbo oculare. Droga che prefLe cellule T della memoria efficace, come gli inibitori selettivi del canale di potassio Kv1.3, possono quindi avere un beneficio terapeutico per l'autoimmunità del DED 28 .

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrebbero ringraziare la signora Tin Min Qi e il dottor Veluchamy Amutha Barathi e la sua squadra per il loro aiuto nella gestione degli animali. Questo lavoro è stato sostenuto da NHIC-I2D-1409007, SingHealth Foundation SHF / FG586P / 2014 e NMRC / CSA / 045/2012.

Materials

Reagents
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P2714-1BTL
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermal Scientific 23227
Mycobacterium tuberculosis H37Ra  Becton, Dickinson and company 231141
complete Freund's adjuvant Becton, Dickinson and company 231131
ovalbumin Sigma-Aldrich A5503-10G
incomplete Freund's adjuvant  Sigma-Aldrich F5506-6X10ML
pertussis toxin  Sigma-Aldrich P7208-50UG
fluorescein sodium solution Bausch & Lomb U.K Limited NA
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Sonicator Sonics  Vibra-Cell
phenol red thread Tianjin Jingming New Technological development Co. LTD. NA
Stereo microscope with ring light illuminator and camera Carl Zeiss NA
Micro IV microscope  Phoenix Research Labs NA
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Autoimmune Dry EyeRat ModelLacrimal GlandEffector Memory T CellsOcular DiseaseLymphocyte TraffickingSprague Dawley RatLacrimal Gland ExtractFreund’s AdjuvantOvalbumin

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Hou, A., Bose, T., Chandy, K. G., Tong, L. A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue. J. Vis. Exp. (124), e55592, doi:10.3791/55592 (2017).
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