כרוני אוטואימונית יבש עין עכברוש דגם עם הגדלת זיכרון תאי זיכרון T ב Eyeball רקמות

בעלי חיים טופלו על פי הנחיות מוסדיות ועל הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים בחקר עיניים וחזון. פרוטוקול המחקר אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת SingHealth. 1. הכנת תמצית בלוטת דלקת הערה: חולדות היו הרדים עם הזרקת intraperitoneal של קטמין (75 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג). הרדמה נכונה אושרה על ידי צובט הבוהן וזנב צביטה. ג'ל עיניים הוחל על העיניים חולדה כדי למנוע יובש לאחר כל הליך. העכברושים הרדים הונחו תחת אורות אינפרא-אדום רחוקים כדי לשמור על החיות החמות עד להחלמה מלאה. במהלך ההליכים וזמן ההחלמה, בעלי חיים היו במעקב הדוק על ידי חוקרים. כל החומרים וכלי הניתוח היו סטריליים לפני השימוש. בסוף הניסוי, חולדות היו מורדמים על ידי הזרקת intraperitoneal של pentobarbital (80 מ"ג / ק"ג).המתת חסד מלאה אומתה על ידי חוסר דופק לב ולא רפלקס למצמץ על ידי נגיעה בעין העין. חולדות שוכנו בתנאים סטנדרטיים: טמפרטורת החדר, 21-23 מעלות צלזיוס; לחות יחסית, 30-70%; אור כהה מחזור, לסירוגין 12 שעות (7 עד 7 בערב). מניחים את חולדות Sprague-Dawley הנרצחות (טווח גילאים בין 8 שבועות ל -16 שבועות), עם אוזן אחת על השולחן והשנייה פונות כלפי מעלה. הפוך חתך 10 מ"מ מעולה – מתחת לאוזן חשוף עם זוג מספריים האביב. הסר את בלוטת הדיסק על ידי לנתח אותו מרקמת החיבור הסובבת מן צינור ניקוז. חנות הבלוטות ב -80 מעלות צלזיוס עד הנדרש. להפשיר את הבלוטות על הקרח. מינס דק ככל האפשר על קרח עם מספריים. הוסף 150 μL של PBS עם מעכב פרוטאז 1x לכל בלוטת דמעות. Sonicate את דגימות על הקרח במשך 5 דקות ב 20 קילוהרץ עם להגדיר sonicator ב 10 על, 10 שניות הנחה במשרעת 30%. צנטריפוגה את הבןדגימות icated עבור 20 דקות ב XG 13,000 ו 4 ° C. פיפטה supernatant ולהעביר אותו צינור חדש. Aliquot supernatant צינורות 1.5 מ"ל ולאחסן אותם -80 מעלות צלזיוס. למדוד את ריכוז החלבון עם assay חומצה bicinchoninic 22 , בהתאם להוראות היצרן. 2. הכנת תחליב ועמילן Toxin אֵמוּלְסִיָה הוסף 40 מ"ג של חום נהרג Mycobacterium שחפת H37Ra לתוך 10 מ"ל של adjuvant של פרוינד להשלים המכיל 1 מ"ג / מ"ל Mycobacterium שחפת H37Ra ומערבבים היטב. הערה: להשלים את adjuvant הסופי של Freund מכיל 5 מ"ג / מ"ל Mycobacterium שחפת H37Ra . לשקול את ovalbumin, להמיס אותו PBS, ולהכין תערובת אנטיגן המכיל 2 מ"ג / מ"ל ​​ovalbumin ו 10 מ"ג / מ"ל ​​תמצית בלוטת דרכי הלב. מכוון עבור נפח הזרקה של 200 μL עבור כל חיה, להכין תערובת אב בכמו על מספרי בעלי החיים. העברת ADJVVANT שלם של Freund או להשלים של adjuvant של Freund לצינור 50 מ"ל, להבטיח כי נפח adjuvant לתערובת אנטיגן הוא ביחס 1: 1. הוסף את תערובת אנטיגן ירידה על ידי ירידה אל adjuvant בעוד vortexing עם המהירות הגבוהה ביותר כי לא לגרום לשפכים. המשך vortexing במשך 5 דקות לאחר כל אנטיגן נוספה. מעבירים את תחליב מזרק 5 מ"ל ולקשר אותו עם מזרק 5 מ"ל אחר דרך מחבר מזרק. דחפו את האמולסיה מזרק אחד לשני כדי לערבב אותו. הערה: תחליב מוכן אם טיפה אחת נשארת ככדור כאשר הניח במים. רק טריים אמולסיה מוכן או מאוחסן מאוחסן לילה ב 4 ° C יש להשתמש. רעלן העובר לשחזר 50 מיקרוגרם של רעלן שעלת μL 500 של מים לעשות ריכוז סופי של 100 ng / μL. ווטקס מיכל עבור 30 s כדי לוודא את tאוקסין מתמוסס לחלוטין. הערה: אין לעקר על ידי סינון, שכן זה יוביל לאובדן של חומר. אל תקפא. פתרון זה נשאר פעיל לפחות 6 חודשים ב 4 ° C. לדלל 100 ng / μL של רעלן שעלת ל 3 ng / μL באמצעות PBS. העברת 100 μL של רעלן שעלת מדולל ל 1 מ"ל Luer-lock מזרק הזרקת עם מחט 27 G. 3. חיסון של חולדות לואיס ביום 0, לערבב את האמולסיה כמה פעמים. הפצת 200 μL של תחליב, המכיל 1 מ"ג של תמצית בלוטת דרכי ו 200 מיקרוגרם של ovalbumin ב adjuvant של פרוינד מלאה, לתוך 1 מ"ל לואר- lock מזרקים עם מחטים 27G. להזריק את תחליב תת עורית בבסיס זנב חולדה ללא הרדמה. הערה: הזנב אינו צריך להיות מראש חימם לפני ההזרקה. כל עכברוש הוא מחוסן עם 1 מ"ג של תמצית בלוטת דרכי ו 200 מיקרוגרם של ovalbumin ב להשלים של אדג '500 מיקרוגרם של Mycobacterium שחפת H37Ra . ביום 14, להזריק 200 μL של תחליב, המכיל 1 מ"ג של תמצית בלוטת דרכי ו 200 מיקרוגרם של ovalbumin ב adjuvant שלם של Freund, באותו אופן כמו ביום 0. להזריק 300 ננוגרם של רעלן שעלת ב 100 μL של PBS intraperitoneally לכל עכברוש באותו יום. 4. הזרקה של תערובת אנטיגן לתוך Subconjunctiva Forniceal ו בלוטת דמעות לגייס תאים אנטיגן ספציפי החיסון לגרום דלקת מקומית חישוב כמות של ovalbumin ו דלקת הבלוטות דלקת מבוסס על מספר חולדות בניסוי. לשקול את הכמות הנדרשת של ovalbumin ולשלב אותו עם תמצית בלוטת דמעות מופשר מוכן בשלב 1, מה שהופך פתרון אנטיגן המכיל 1 מ"ג / מ"ל ​​ovalbumin ו 1 מ"ג / מ"ל ​​תמצית בלוטת הדמעות. להרדים את החולדות עם קטמין (75 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג) על ידי הזרקה intraperitoneal. צבוט אתEs של חולדות כדי להבטיח הרדמה נאותה הושגה ( כלומר, אין תגובה התנועה הוא ציין לאחר קמצוץ). להזריק 5 μL של אנטיגן לתוך subconjunctiva forniceal של העין. להזריק 20 μL של אנטיגן לתוך בלוטת דמעות. 5. הערכה של תכונות עין יבשה הערה: עבור צעדים 5.1-5.3, עכברים הרדים צריך להיות מוחזק בעדינות על ידי יד כפפה במצב זקוף על משטח שטוח, כדי למנוע תנועה. למדוד את נפח הדמעה עם חוט אדום פנול. השתמש זוג אחד של מלקחיים להחזיק את החוט ועוד למשוך את העפעף התחתון של עכברוש. מניחים את החוט בפינה הפרוקסימלית של fornix התחתון במשך דקה 1 ולאחר מכן להסיר את פתיל. הערה: הדמעות הופכות את החלק הרטוב של החוט אדום לצבע. צלם תמונה של אורך החלק הרטוב של החוט ליד סרגל עם סימוני מילימטר. מדוד את אורך הרטבה לעשיריתFa millimeter באמצעות תוכנת תמונה ( למשל, ImageJ). מדוד את הקרנית / החלקות. מניחים את החולדה תחת stereomicroscope מצויד מאיר טבעת ומצלמה. החל 5 μL של מלוחים על הקרנית חולדה. פסיבי למצמץ על ידי הזזת העפעפיים העליונים והתחתונים עם אצבעות כפפות ~ 5 פעמים כדי להפיץ את מלוחים. פוקוס את הטבעת מאירה על משטח משטח הקרנית תחת הגדלה 1.6x. רכישת תמונות צילום לאחר 10 s. הערה: מאירה הטבעת פרויקטים שתי שורות מעגליות של תמונות נקודה על הקרניות של החיה. ריווח קבוע של הנקודות הבלתי מסודרות מציע שכבה חלקה של הקרנית / דמעה. מדוד נזק הקרנית עם מכתים פלואורסצין. הוסף 2 μL של 0.2% פלואורסצין הקרנית עכברוש. פתח וסגור את העפעפיים חולדה 3 פעמים עם אצבע כפפה כדי להפיץ את צבע פלואורסצין על פני העין. <lI> לאחר 1 דקות, לצייר 1 מ"ל של תמיסת מלח עם מזרק 3 מ"ל (ללא כל המחט המחט), למקם את המזרק על 2-3 מ"מ הקדמי לקרנית, בעדינות להניע מלוחים על העין. לרכוש תמונות תחת מסנן כחול קובלט ( כלומר, ~ 400 ננומטר) של מיקרוסקופ הדמיה ocular עם אורות הרקע כבוי. הערה: תמונות לאחר מכן נותחו על ידי מערכת לדירוג שונה מפרסומים קודמים 23 . תמונות נותחו על ידי סובייקטיבי לדירוג מספר, אזור ועוצמה של כתמים ירוקים מ 0 עד 2, שם 0 מציין שלהם נעדר, 1 מציין מכתים לדקלם של פחות מ 50 מקומות, ו 2 מציין מכתים לנקב של יותר מ 50 מקומות. להרדים את החולדות דרך הזרקת intraperitoneal של pentobarbital (80 מ"ג / ק"ג). הסר את העפעפיים העליונים והתחתונים באמצעות מספריים. תקן ו לצנוח את eyeballs ידי לחיצה על רקמות periocular עם מלקחיים. חינם את העולם על ידי ניתוק tהוא שריר חוץ, העצב האופטי, ואת הלחמית. לתקן את המיקום של גלגל העין חולדה עם מלקחיים ולפתוח אותו עם חתך היקפי לאורך קו המשווה. הסר את העדשה הזגוגית. שים את גלגלי העין גזור לתוך צינורות 1.5 מ"ל על הקרח. איסוף בלוטות דרכי, כמתואר בשלב 1.1. מיד להעביר את גידולי העין גזור ובלוטות דרכי למעבדה להתכונן ניתוח cytometry זרימה. מבודד את תאי החיסון עם collagenase ו dispase II שיטות העיכול 24 , 25 . המשך להשתמש cytometry הזרימה לפרופיל תת T-subbopulation ברקמות העין 26 . הערה: לוח הנוגדנים הוא: אנטי CD4APC-Cyanine7 (OX-1), אנטי CD3 BV421 (1F4), אנטי CD4 PE-Cyanine7 (OX-35), אנטי CD45RC Alexa647 (OX-22), אנטי -CD62 PE (HRL1), נגד CD44 FITC (OX-50), ואת הכדאיות תא צבע 7-AAD. בין CD45 + CD3 <sup( + CD + CD45RC + ), זיכרון המפעיל (T EM, CD3 + CD45RC – CD44 + CD62L – ), וזיכרון מרכזי (T CM, CD3 + CD45RC – CD44 + CD62L + ) .