Een Chronisch Autoimmuun Droog Oog Rat Model Met Toename In Effector Geheugen T Cellen In Oogappel Weefsel

Dieren werden behandeld volgens de institutionele richtlijnen en de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oog- en visieonderzoek. Het studieprotocol werd goedgekeurd door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van SingHealth. 1. Bereiding van Lacrimal Gland Extract OPMERKING: Ratten werden verdoofd met de intraperitoneale injectie van ketamine (75 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg). Behoorlijke verdoving werd bevestigd door teen knijpen en staart knijpen. Oftalmische gel werd aangebracht op de rat ogen om droogte na elke procedure te voorkomen. De verdovende ratten werden onder verre infraroodlampen geplaatst om de dieren warm te houden tot ze volledig hersteld werden. Tijdens de procedures en de hersteltijd werden dieren nauwlettend gecontroleerd door onderzoekers. Alle materialen en chirurgische gereedschappen waren steriel voor gebruik. Aan het einde van het experiment werden ratten geëuthaniseerd door de intraperitoneale injectie van pentobarbital (80 mg / kg).Volledige euthanasie werd geverifieerd door een gebrek aan hartpuls en geen blinkreflex door de oogballen aan te raken. Ratten werden gehuisvest in standaard omstandigheden: kamertemperatuur, 21-23 ° C; Relatieve luchtvochtigheid, 30-70%; Licht-donkere cyclus, afwisselend 12 uur (7 uur tot 7 uur). Plaats de geëuthaniseerde vrouwelijke Sprague-Dawley ratten (leeftijd van 8 weken tot 16 weken) vlak, met één oor tegen de tafel en de andere naar boven. Maak een 10 mm incisie superieur-inferiorly onder het blootgestelde oor met een paar lentenschaar. Verwijder de lacrimale klier door dissecteren van het omliggende bindweefsel en van de afvoerleiding. Bewaar de klieren bij -80 ° C totdat dit nodig is. Doe de klieren op ijs. Gehakt zo fijn mogelijk op ijs met een schaar. Voeg 150 μL PBS toe met 1x proteaseremmer per lacrimale klier. Soniceer de monsters op ijs gedurende 5 minuten bij 20 kHz met de sonicator ingesteld op 10 s aan, 10 s uit bij 30% amplitude. Centrifugeer de zoonGegoten monsters gedurende 20 minuten bij 13.000 xg en 4 ° C. Pipet de supernatant en breng het over naar een nieuwe buis. Aliquot de supernatant naar 1,5 ml buizen en sla ze op -80 ° C. Meet de eiwitconcentratie met een bicinchoninezuurassay 22 volgens de instructies van de fabrikant. 2. Bereiding van Emulsie en Pertussis Toxine Emulsie Voeg 40 mg warmte-gedood Mycobacterium tuberculosis H37Ra toe in 10 ml compleet Freund's adjuvans dat 1 mg / ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra bevat en meng goed. OPMERKING: De uiteindelijke complete Freund's adjuvante bevat 5 mg / ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra. Weeg het ovalbumine, oplos het in PBS en berei een antigeenmengsel op met 2 mg / ml ovalbumine en 10 mg / ml lacrimale klier extract. Voor een injectievolume van 200 μL voor elk dier, bereiden een meermengsel bAls op de dierengetallen. Breng onvolledige Freund's adjuvant over of voeg Freund's adjuvans toe aan een 50 ml buis, zodat de hoeveelheid adjuvans aan het antigeenmengsel in een verhouding van 1: 1 ligt. Voeg de antigeenmengsel drop-by-drop toe aan het adjuvans, terwijl de vortexing met de hoogste snelheid niet leidt tot morsen. Blijf vortexeren gedurende 5 minuten nadat al het antigeen is toegevoegd. Breng de emulsie over op een 5 ml spuit en verbind deze met een andere 5 ml spuit via een injectiespuit. Duw de emulsie van de ene spuit naar de andere om het te mengen. OPMERKING: De emulsie is klaar als een enkele druppel als een bol blijft als het in water wordt geplaatst. Alleen vers bereide emulsies of emulsies die nachtelijk bij 4 ° C worden opgeslagen, dienen te worden gebruikt. Pertussis toxine Reconstitute 50 μg pertussis toxine in 500 μl water om een ​​uiteindelijke concentratie van 100 ng / μL te maken. Votex de container gedurende 30 s om ervoor te zorgen dat de tOxine lost volledig op. OPMERKING: Steriliseer niet door filtratie, omdat dit materiaalverlies zal veroorzaken. Niet bevriezen. Deze oplossing blijft gedurende minstens 6 maanden bij 4 ° C actief. Verdun 100 ng / μL pertussis toxine tot 3 ng / μl met behulp van PBS. Breng 100 μL van het verdunde pertussis toxine over op een 1 ml Luer-lock injectiespuit met een 27 G-naald. 3. Immunisatie van de Lewis-ratten Op dag 0 meng de emulsie een paar keer. Verdeel 200 μL van de emulsie, die 1 mg lacrimale extract bevat en 200 μg ovalbumine in complete Freund's adjuvans, in 1 ml Luer-lock spuiten met 27G naalden. Spuit de emulsie subcutaan aan de basis van de ratstaarten zonder verdoving. OPMERKING: De staart hoeft niet voorverwarmen te worden vóór de injectie. Elke rat wordt geïmmuniseerd met 1 mg lacrimale klier extract en 200 μg ovalbumine in complete Freund's adjuvans witH 500 μg Mycobacterium tuberculose H37Ra. Op dag 14 injecteer 200 μl van de emulsie, die 1 mg lacrimale extract en 200 μg ovalbumine in onvolledig adjuvant Freund bevat, op dezelfde wijze als op dag 0. Spuit 300 ng pertussis toxine in 100 μl PBS intraperitoneaal Per rat op dezelfde dag. 4. Injectie van het Antigene Mengsel in het Forniceal Subconjunctiva en Lacrimale Klier om Antigenspecifieke Immuuncellen Recruit En Oorzaak Lokale Ontsteking Bereken het aantal ovalbumine- en lacrimale klier extract op basis van het aantal ratten in het experiment. Weeg de benodigde hoeveelheid ovalbumine en combineer het met het ontdooide lacrimale klier uittreksel bereid in stap 1, waarbij een antigeen oplossing die 1 mg / ml ovalbumine en 1 mg / ml lacrimale klier extract bevat. Verdoof de ratten met ketamine (75 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) door intraperitoneale injectie. Knijp het aanVan ratten om ervoor te zorgen dat de juiste verdoving is bereikt ( dwz, geen responsieve beweging wordt waargenomen na de knijp). Spuit 5 μL antigeen in de forniceale subconjunctiva van het oog. Injecteer 20 μl antigeen in de lacrimale klier. 5. Beoordeling van de eigenschappen van de droge ogen OPMERKING: Voor stappen 5.1-5.3 moeten de verdovende ratten voorzichtig worden gehouden met een handgeschoven hand in een rechtopstaande positie op een vlakke ondergrond om beweging te vermijden. Meet het traanvolume met fenol rode draad. Gebruik een paar tang om de draad vast te houden en een ander om de onderste ooglid van de rat te trekken. Plaats de draad in de proximale hoek van de onderste fornix gedurende 1 minuut en verwijder vervolgens de draad. OPMERKING: Tranen maken het bevochtigde deel van de draad rood van kleur. Neem een ​​afbeelding van de lengte van het bevochtigde deel van de draad naast een liniaal met millimeter markeringen. Meet de bevochtigde lengte op de tiende oFa millimeter met behulp van een beeldsoftware ( bijv. ImageJ). Meet de hoornvliesheid / cornea. Plaats de rat onder een stereomicroscoop uitgerust met een ringverlichting en een camera. Breng 5 μl zoutoplossing aan op de hoornvlies van de rat. Knipper passief door de bovenste en onderste oogleden te bewegen met glove vingers ~ 5 keer om de zoutoplossing te verspreiden. Focus de ringverlichting op het midden van het hoornvliesoppervlak onder 1,6x vergroting. Verkrijg fotografische beelden na 10 s. OPMERKING: De ringverlichting projecteert twee cirkelvormige rijen stippenbeelden op de hoornvlies van het dier. Regelmatige verdeling van de onverteerde stippen suggereert een gladde hoornvlies / scheurlaag. Meet cornea schade met fluorescein kleuring. Voeg 2 μL 0,2% fluoresceïne toe aan de hoornvlies van de rat. Open de schouderlidleden 3 keer passief en sluit deze met een glove vinger om de fluoresceine kleurstof op het oppervlak van het oog te verspreiden. <lI> Na 1 minuut trek 1 ml zoutoplossing met een 3 ml spuit (zonder naaldbevestiging), plaats de spuit ongeveer 2-3 mm voor de hoornvlies, en breng zout op het oog zachtjes. Verkrijg beelden onder het kobaltblauw filter ( dwz ~ 400 nm) van een oculaire beeldmicroscoop met de achtergrondlampjes uitgeschakeld. OPMERKING: Beelden werden vervolgens geanalyseerd door een cijfersysteem dat is gewijzigd van eerdere publicaties 23 . Beelden werden vervolgens geanalyseerd door het aantal, de oppervlakte en de intensiteit van de groene vlekken van 0 tot 2 individueel te classificeren, waar 0 hun afwezigheid aangeeft, 1 wijst op punctaatkleuren van minder dan 50 plekken en 2 wijst op punctaatkleuring van meer dan 50 plekken. Euthanize de ratten door de intraperitoneale injectie van pentobarbital (80 mg / kg). Verwijder de bovenste en onderste oogleden met behulp van een schaar. Bevestig en prolaps de oogballen door op de perioculaire weefsels te drukken met tang. Bevrijd de wereld door t te scheidenHij extraoculaire spieren, de optische zenuw en het forniceal conjunctiva. Bevestig de positie van de rat-oogballetje met tang en open deze met een omtrek in de hoek van de equator. Verwijder de lens en glazen. Zet de gedroogde oogballen in 1,5 ml buizen op ijs. Verzamel de lacrimale klieren, zoals beschreven in stap 1.1. Breng de gedissendeerde ooglapweefsels en lacrimale klieren onmiddellijk door naar het laboratorium om voor de flowcytometrie-analyse voor te bereiden. Geïsoleerde de immuuncellen met collagenase en dispas II digestiemethoden 24 , 25 . Ga verder met gebruik van stromingscytometrie om de T-cel subpopulatie in de ooglapweefsels te profileren 26 . OPMERKING: Het paneel van antilichamen zijn: anti-CD45APC-Cyanine7 (OX-1), anti-CD3 BV421 (1F4), anti-CD4 PE-Cyanine7 (OX-35), anti-CD45RC Alexa647 (OX-22) -CD62 PE (HRL1), anti-CD44 FITC (OX-50) en levensvatbaarheidscel kleurstof 7-AAD. Onder de CD45 + CD3 <sup> + 7AAD – populatie, naïef (CD3 + CD45RC + ), effectorgeheugen (T EM, CD3 + CD45L – ), en centraal geheugen (T CM, CD3 + CD45RC – CD44 + CD62L + ) .