A المناعة الذاتية الجفاف العين الفئران نموذج مع زيادة في المفعول الذاكرة خلايا T في الأنسجة مقلة العين
Summary
يصف هذا التقرير طريقة للحث على جفاف المناعة الذاتية المزمن التجريبي العين في الفئران لويس من خلال التحصين مع مستحلب من الفئران استخراج الغدة الدمعية، البيضاوي، وكاملة المساعد فروند، تليها حقن مستخرج الغدة الدمعية والأوفالبومين في الملتحمة تحت الجلد والقرنية الدمعية بعد ستة أسابيع.
Abstract
مرض العين الجافة هو حالة شائعة جدا أن يسبب المراضة وعبء الرعاية الصحية ويقلل من نوعية الحياة. هناك حاجة لنموذج جاف العين حيوان مناسب لاختبار العلاجات الجديدة لعلاج أمراض العين الجافة المناعة الذاتية. يصف هذا البروتوكول نموذج المناعة الفئران جفاف العين المزمن الذاتي. تم تحصين الفئران لويس مع مستحلب يحتوي على استخراج الغدة الدمعية، البيضاوي، وكامل مساعد فروند. تم إعطاء التحصين الثاني مع نفس المستضدات في مساعد فرويند غير مكتملة بعد أسبوعين. تم إعطاء هذه التحصينات تحت الجلد في قاعدة الذيل. لتعزيز الاستجابة المناعية في سطح العين والغدد الدمعية، تم حقن مستخلص الغدة الدمعية والبيض البيضاوي في الملتحمة تحت الشبكية والغدد الدمعية 6 أسابيع بعد أول تحصين. وضعت الفئران ميزات جافة العين، بما في ذلك انخفاض المسيل للدموع الإنتاج، وانخفاض الاستقرار المسيل للدموع، وزيادة الضرر القرنية. المناعي المواليةالايداع عن طريق التدفق الخلوي أظهر رجحان الخلايا CD3 + المستجيب T في مقلة العين.
Introduction
مرض العين الجاف (دد) هو مرض متعدد العوامل من الدموع والسطح العين التي تؤدي إلى أعراض عدم الراحة، واضطراب البصرية، وعدم الاستقرار فيلم المسيل للدموع، والتي يمكن أن تؤدي إلى الأضرار التي لحقت سطح العين. ويرافق ذلك زيادة الأسمولية من الفيلم المسيل للدموع والتهاب سطح العين 1 . الأعراض المصاحبة ل ديد هي حرق، لاذع، والشعور، والإحساس جسم غريب، وتمزيق، والتعب العين، وجفاف 2 ، 3 . ويتم تقليل السببين الرئيسيين لدائرة التنمية الاقتصادية في إنتاج المسيل للدموع عن طريق غدة إفراز المسيل للدموع والتبخر المفرط للفيلم المسيل للدموع 4 . في المرضى الذين يعانون من أمراض المناعة الذاتية، مثل متلازمة سجوجرن، الذئبة الحمامية الجهازية، والتهاب المفاصل الروماتويدي الضرر المناعي للغدد ميبوميان يقلل من التعبير عن الدهون الأساسية للاستقرار المسيل للدموع. أيضا، الضرر المناعي لسطح العين يقلل برودوكتيعلى من موسينز مهم لسطح قابل للبلل. معا، وهذه العمليات يسبب تراكميا جفاف المزمن العين 5 ، 6 ، 7 .
استبدال المسيل للدموع والعلاج المضادة للالتهابات هي الدعائم الأساسية للعلاج. ومع ذلك، العلاجات المضادة للالتهابات الحالية ل ديس ( أي الكورتيزون والسيكلوسبورين) هي مناعة على نطاق واسع، مما يؤدي إلى آثار ضارة خطيرة 8 ، 9 ، 10 . هناك حاجة لنموذج حيواني مناسب لاختبار العوامل المناعية الرواية لعلاج العين الجافة المناعية الذاتية.
الفئران مع عيوب وراثية محددة 11 ، 12 ، 13 ، الفئران تفتقر إلى جينات محددة 14 ، 15 ، والفئران المعدلة وراثيا أوفيركسريسينغ إمونوريغولاتوقد استخدمت الجينات أوري كنماذج من المناعة الذاتية جفاف العين 16 ، 17 . كما تم الإبلاغ عن نماذج حيوان المناعة الذاتية التي يسببها المستضد في الفئران 18 ، الأرانب 19 ، والجرذان 20 ، 21 . هنا، نحن تصف نموذج المستضد الناجم عن العين الجافة المناعية المزمن. هذا النموذج هو تعديل اثنين من النماذج السابقة. واحد يستخدم مقتطفات الغدة الدمعية، والثانية تستخدم مولد تلقائي ( أي klk1b22) من الغدد الدمعية 20 ، 21 .
تم تحريض هذا المرض عن طريق التحصين تحت الجلد من 6 إلى 8 من العمر الإناث الفئران لويس مع البيضاوي، وكامل المساعد فرويند، ومستحلب يحتوي على مقتطفات الغدة الدمعية من الجرذان سبراغ داولي ( الشكل 1 ). وكان التحصين الثاني مع نفس المستضد في مساعد فرويند غير مكتملةتدار بعد أسبوعين. لتجنيد الخلايا المناعية المستضد محددة إلى الغدة الدمعية وسطح العين، تم حقن خليط من استخراج الغدة الدمعية والبويضات (1 ملغ / مل) في الملتحمة تحت الجلد والقرنية الدمعية في الأسبوع ال 6 7TH ( الشكل 1 ). أكثر من 85٪ من الفئران وضعت سمات مميزة من جفاف العين بعد 70 يوما من التحصين الأول. وتشمل هذه الميزات انخفاض المسيل للدموع الإنتاج ( الشكل 2 )، وزيادة تلطيخ فلوريسئين القرنية ( الشكل 3 )، وانخفاض الاستقرار المسيل للدموع ( الشكل 4 ). التنميط المناعي للخلايا التائية في مقل العيون من الفئران العادية عن طريق التدفق الخلوي يكشف عن رجحان الخلايا CD3 + المستجيب T ( الشكلين 5 و 6 ). الفئران مع المناعة الذاتية دائرة التنمية الاقتصادية تظهر زيادة في CD3 + خلايا الذاكرة المستجيب T وانخفاض المقابلة في الخلايا السذاجة الذاكرة T المركزية ( الشكل 6 </stroنانوغرام>).
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوة حاسمة من هذا البروتوكول هو ضمان تجانس مستحلب. في مستحلبات جيدة الإعداد، ومغذيات مستضد تماما مع النفط، وضمان الإفراج البطيء من مستضد حقن والتحفيز المناعي المستمر. ميزة حاسمة أخرى من هذا البروتوكول هو استخدام الفئران لويس. الفئران لويس هي أكثر حساسية لتطوير أمراض المناعة الذاتية من سلالات أخرى 27 .
وقد تم تعديل هذا البروتوكول من اثنين من البروتوكولات المنشورة سابقا، والتي إما تستخدم استخراج الغدة الدمعية فقط أو المؤتلف Klk1b22 20 ، 21 . في البروتوكول الحالي، وتستخدم البيض البيضاوي بالإضافة إلى استخراج الغدة الدمعية كما مستضد، وتنجذب الخلايا المناعية المستضد محددة إلى سطح العين والغدة الدمعية، مما أدى إلى تلف الأنسجة المحلية. العين الجافة تتطور ببطء، ليصل ~ 85٪ بعد يوم 48 بعد التحصين الأولي. تحدي أنتيجيني إلىالعين والغدة الدمعية في يوم 48 تفاقم جفاف العين ويضمن مزمنها حتى يوم 70.
وبالمقارنة مع Clk1b22 المؤتلف في نموذج ديد التي يسببها كلك، ومستخلص الغدة الدمعية والأوفالبومين المستخدمة في النموذج الحالي هي أرخص وأسهل للحصول عليها. يحتوي مستخلص الغدة الدمعية أيضا على بروتينات أخرى، وبصرف النظر عن كلك، التي قد تحفز المناعة الذاتية، لذلك هذا المقتطف هو نظريا أكثر فعالية من طريقة كلك في حفز دائرة التنمية الاقتصادية. لقد حاولنا أيضا تحصين الفئران مع استخراج الغدة الدمعية فقط. على الرغم من أن هذه الفئران المحصنة وضعت دائرة التنمية الاقتصادية، لم يكن هناك زيادة كبيرة في الخلايا T الذاكرة المستجيب في أنسجة مقلة العين مقارنة مع الضوابط.
الحد من هذه التقنية هو أنه يأخذ 70 يوما لتحقيق النموذج. الخلايا المفرطة الخلايا التائية هي مجموعات فرعية من الخلايا التائية الرئيسية في العين الفئران العادية. في هذا النموذج، ونتائج دائرة الرقابة الذاتية المناعة الذاتية في زيادة CD3 + المستجيب خلايا T الذاكرة في مقلة العين. المخدرات التي بريفقمع كبريا خلايا المستجيب الذاكرة T، مثل مثبطات انتقائية لقناة البوتاسيوم Kv1.3، وبالتالي قد يكون لها فائدة علاجية على المناعة الذاتية ديد 28 .
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا السيدة تين مين كي والدكتور فيلوشامي أموثا باراثي وفريقها على مساعدتهم في التعامل مع الحيوانات. وأيد هذا العمل من قبل نيك-I2D-1409007، مؤسسة سينغهيلث شف / FG586P / 2014، و نمرك / سسا / 045/2012.
Materials
| Reagents | |||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermal Scientific | 23227 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37Ra | Becton, Dickinson and company | 231141 | |
| complete Freund's adjuvant | Becton, Dickinson and company | 231131 | |
| ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503-10G | |
| incomplete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506-6X10ML | |
| pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P7208-50UG | |
| fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Sonicator | Sonics | Vibra-Cell | |
| phenol red thread | Tianjin Jingming New Technological development Co. LTD. | NA | |
| Stereo microscope with ring light illuminator and camera | Carl Zeiss | NA | |
| Micro IV microscope | Phoenix Research Labs | NA |
References
- . The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). Ocul Surf. 5 (2), 75-92 (2007).
- Gayton, J. L. Etiology, prevalence, and treatment of dry eye disease. Clin Ophthalmol. 3, 405-412 (2009).
- Tong, L., Tan, J., Thumboo, J., Seow, G. The dry eye. Praxis (Bern 1994). 102 (13), 803-805 (2013).
- Messmer, E. M. The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease. Dtsch Arztebl Int. 112 (5), 71-81 (2015).
- Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Curr Allergy Asthma Rep. 14 (1), 403 (2014).
- Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Arch Ophthalmol. 130 (1), 90-100 (2012).
- Tong, L., Thumboo, J., Tan, Y. K., Wong, T. Y., Albani, S. The eye: a window of opportunity in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (9), 552-560 (2014).
- Carnahan, M. C., Goldstein, D. A. Ocular complications of topical, peri-ocular, and systemic corticosteroids. Curr Opin Ophthalmol. 11 (6), 478-483 (2000).
- Johannsdottir, S., Jansook, P., Stefansson, E., Loftsson, T. Development of a cyclodextrin-based aqueous cyclosporin A eye drop formulations. Int J Pharm. 493 (1-2), 86-95 (2015).
- Prabhasawat, P., Tesavibul, N., Karnchanachetanee, C., Kasemson, S. Efficacy of cyclosporine 0.05% eye drops in Stevens Johnson syndrome with chronic dry eye. J Ocul Pharmacol Ther. 29 (3), 372-377 (2013).
- Ishimaru, N., et al. Severe destructive autoimmune lesions with aging in murine Sjogren’s syndrome through Fas-mediated apoptosis. Am J Pathol. 156 (5), 1557-1564 (2000).
- Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Holmdahl, R., Klareskog, L. Sialadenitis in the MRL-l mouse: morphological and immunohistochemical characterization of resident and infiltrating cells. Immunology. 60 (4), 611-616 (1987).
- Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Klareskog, L. Immunohistochemical characterization of sialadenitis in NZB X NZW F1 mice. Clin Immunol Immunopathol. 42 (1), 93-101 (1987).
- Li, H., Dai, M., Zhuang, Y. A T cell intrinsic role of Id3 in a mouse model for primary Sjogren’s syndrome. Immunity. 21 (4), 551-560 (2004).
- Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-beta 1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
- Green, J. E., Hinrichs, S. H., Vogel, J., Jay, G. Exocrinopathy resembling Sjogren’s syndrome in HTLV-1 tax transgenic mice. Nature. 341 (6237), 72-74 (1989).
- Shen, L., et al. Development of autoimmunity in IL-14alpha-transgenic mice. J Immunol. 177 (8), 5676-5686 (2006).
- Hayashi, Y., Hirokawa, K. Immunopathology of experimental autoallergic sialadenitis in C3H/He mice. Clin Exp Immunol. 75 (3), 471-476 (1989).
- Liu, S. H., Zhou, D. H. Experimental autoimmune dacryoadenitis: purification and characterization of a lacrimal gland antigen. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (6), 2029-2036 (1992).
- Liu, S. H., Prendergast, R. A., Silverstein, A. M. Experimental autoimmune dacryoadenitis. I. Lacrimal gland disease in the rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 28 (2), 270-275 (1987).
- Jiang, G., et al. A new model of experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca (KCS) induced in Lewis rat by the autoantigen Klk1b22. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (5), 2245-2254 (2009).
- Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
- Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride. Mol Vis. 17, 257-264 (2011).
- Cousins, S. W., Streilein, J. W. Flow cytometric detection of lymphocyte proliferation in eyes with immunogenic inflammation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 31 (10), 2111-2122 (1990).
- Yawata, N., et al. Dynamic change in natural killer cell type in the human ocular mucosa in situ as means of immune evasion by adenovirus infection. Mucosal Immunol. 9 (1), 159-170 (2016).
- Chen, Y., Chauhan, S. K., Lee, H. S., Saban, D. R., Dana, R. Chronic dry eye disease is principally mediated by effector memory Th17 cells. Mucosal Immunol. 7 (1), 38-45 (2014).
- Goldmuntz, E. A., et al. The origin of the autoimmune disease-resistant LER rat: an outcross between the buffalo and autoimmune disease-prone Lewis inbred rat strains. J Neuroimmunol. 44 (2), 215-219 (1993).
- Cahalan, M. D., Chandy, K. G. The functional network of ion channels in T lymphocytes. Immunol Rev. 231 (1), 59-87 (2009).
