JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

تحليل الكهربية من الخلايا الجذعية المستمدة من الخلايا الجذعية البشرية (هسك-كمس) باستخدام صفائف متعدد القطب (مياس)

Published: May 12, 2017
doi:
10.3791/55587
, , , ,
1Department of Anatomy and Embryology,Leiden University Medical Center, 2Department of Applied Stem Cell Technologies,University of Twente

Summary

توصيف الكهربية من العضلية المستمدة من الخلايا الجذعية البشرية المحفزة (هسك-سمس) أمر بالغ الأهمية لنمذجة أمراض القلب وتحديد ردود المخدرات. ويوفر هذا البروتوكول المعلومات اللازمة لفصل و هسك لوحة-سم على صفائف متعدد القطب، وقياس إمكانات مجالها، وطريقة لتحليل كت وفترات ر.

Abstract

ويمكن الآن أن تستمد كارديوميوسيتس مع كفاءة عالية من كل من الجنينية البشرية والبشرية الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (هسك). يتم التعرف على الخلايا العضلية المستمدة من هسك (هسك-سمز) على نحو متزايد باعتبارها ذات قيمة كبيرة لنمذجة أمراض القلب والأوعية الدموية في البشر، وخاصة متلازمات عدم انتظام ضربات القلب. وقد أثبتت أيضا أهميتها كما في أنظمة المختبر للتنبؤ ردود المخدرات، مما يجعلها مفيدة على الأرجح لفحص المخدرات واكتشاف، الصيدلة السلامة وربما في نهاية المطاف للطب شخصية. ويمكن تسهيل ذلك عن طريق اشتقاق هسك-سمس من المرضى أو الأفراد عرضة مثل هبسس. ولكن بالنسبة لجميع التطبيقات، فإن القياس الدقيق وتحليل الخصائص الكهربائية هسك-سم ضرورية لتحديد التغيرات الناجمة عن طفرات القناة الأيونية القلبية و / أو الأدوية التي تستهدف القنوات الأيونية ويمكن أن تسبب الموت القلبي المفاجئ. مقارنة مع دليل التصحيح المشبك، متعددة القطب مجموعة (ميي) الأجهزة توفر ميزةمما يسمح للتسجيلات متوسطة إلى عالية الإنتاجية. يصف هذا البروتوكول كيفية فصل الثقافات خلية 2D من هسك-سمس إلى المجاميع الصغيرة وخلايا واحدة وصفيحة عليها على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف لتسجيل نشاطها الكهربائي عفوية كما إمكانات المجال. وترد هنا أيضا طرق لتحليل البيانات المسجلة لاستخراج معلمات محددة، مثل فترتي كت والفترة الزمنية ر. ومن المتوقع حدوث تغييرات في هذه المعلمات في هسك-سمز تحمل الطفرات المسؤولة عن عدم انتظام ضربات القلب وبعد إضافة أدوية محددة، مما يسمح للكشف عن تلك التي تحمل خطر كارديوتسيك.

Introduction

الخلايا الجذعية المحفزة البشرية (هسس) لديها القدرة على التجديد الذاتي وتوليد تقريبا أي نوع من خلايا الجسم البشري من خلال التمايز 1 ، 2 . وقد وصفت بروتوكولات مفصلة حول كيفية توجيه التمايز هسس في العديد من الأنساب القلبية (البطين، الأذيني، كارديوميوسيتس مثل جهاز تنظيم ضربات القلب) 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 . كارديوميوسيتس هي خلايا نشطة كهربائيا ومعرفة مفصلة من النشاط الكهربية يمكن أن تكون مفيدة للغاية لفهم تطور القلب والمرض 8 . وقد استخدمت خلايا محددة هيبسك المستمدة كارديوميوسيتس (هيبسك-سمز) بنجاح لنمذجة ودراسة الخلوية والجزيئية والكهربائية ميزات عدة عدم انتظام ضربات القلب، بما في ذلك متلازمة كت طويلة(لوتس) 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، متلازمة بروغادا 14 ، وكاثيكولامينرجيك متعدد الأشكال عدم انتظام دقات القلب البطيني 15 ، 16 . وعلاوة على ذلك، تم إضافة أدوية متعددة إلى هيبسك-سم المرضى لخلاصة التدخل العلاجي وإنقاذ المظاهر المرضية الخلوية 10 ، 15 ، 20 ، 21 ، 22 . في الآونة الأخيرة، وقد وضعت منصات الفحص على أساس وت هبسك-سمس، استجابة للحاجة إلى النظم البشرية إلى المراحل المبكرة من اكتشاف المخدرات 23 ، 24 ، 25 كما القوارض كارديوميوسيتس تختلف بشكل عميق عن هومان في أيون قناة التعبير والفيزياء الحيوية 26 .

ولهذا الغرض، يجري تطوير وتنفيذ تكنولوجيات مناسبة للتطبيقات المتوسطة إلى العالية الإنتاجية. وتشمل هذه التسجيلات البصرية من الغشاء المحتملة، كا 2 + العابرين والسلالة، قياسات مقاومة (كإجراء غير مباشر من انقباض الخلية)، والقياسات المحتملة المجال خارج الخلية (فب) (للمراجعة انظر المرجع 24 ). أجهزة متعددة القطب صفائف (ميي) تسمح بتسجيل إشارات الموجي الكهربائي (أو فبس) ولدت وشكلت من قبل مونولايرز أو مجموعات صغيرة من العضلية. كفاف فب يرتبط مع إمكانات القلب العمل، وإلى حد ما، مع تسجيلات تخطيط القلب (إسغ) 27 ؛ فإنها تظهر عادة صعود السريع الأولي المقابلة لتدفق نا + والغشاء الاستقطاب (R / Q الذروة)، وموجة بطيئة / مرحلة الهضبة المرجح أن المقابلة للكالسيوم2+ تدفق، ومرحلة إعادة الاستقطاب المقابلة ل K + الغالب إفلوكس (T الذروة). يمكن ربط اضطراب الموجي فب بالتغيرات في مراحل العمل المحتملة المحتملة 28 .

على الرغم من أن التسجيلات المشبك التصحيح من إمكانيات العمل يمكن أن تكون أكثر إفادة، وخاصة بالنسبة للمعلمات وسرعة أوبستروك واستعادة الغشاء المحتملة، والقياسات اليدوية ليست مجدية للتجارب على نطاق متوسط ​​وعالية الإنتاجية، في حين تم تطبيق المشبك التصحيح الآلي في الآونة الأخيرة فقط إلى هسك -CMs 29 . ومع ذلك، نظرا لأن التسجيلات المطولة على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تسمح بالتعرض الحاد والمزمن للمركبات التي يتعين دراستها، أصبح من الممكن الآن استخدام منصات هسك-سم لفحص المخدرات واكتشافها 24 و 30 ولصحة الأدوية 31 ، 32 . وهذا يحمل الوعد من الدقة في المستقبل أو بيرسوالطب ناليزد 33 .

والغرض من هذا البروتوكول هو توفير المعلومات اللازمة ل ديسوسياتينغ والطلاء هسك-سمس على رقائق ميي وقياس فب بهم. في هذا الإجراء، وقد تم تحسين كل خطوة، وضمان بقاء الخلية الأمثل والانتعاش بعد التفكك، ومرفق الخلية الأمثل إلى لوحة ميي والتحليل الموحد وتقدير المعلمات. على وجه الخصوص، يتم شرح الإجراء لتسجيل خارج الخلية فب، وتحليل كت والفترات ر، وتقييم آثار المخدرات ومثالية.

Protocol

1. إعداد الحلول والكواشف إعداد وسط ثقافة هسك-سم باستخدام منخفض الأنسولين، ألبومين المصل البقري، كحول بولي فينيل، الدهون الأساسية (لي-ببيل) المتوسطة 34 ، 35 ، 36 من خلال الجمع بين الكواشف الموضحة في الجدول 1 . تصفية المتوسطة من خلال مرشح المسام 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع. إعداد الإنسان محلول الأسهم المؤتلف فبرونيكتين من خلال إعادة 1 ملغ من الفيبرونيكتين المؤتلف الإنسان في 5 مل من الماء المقطر العقيمة للوصول إلى 200 ميكروغرام / مل التركيز، قسامة، وتخزينها في -80 درجة مئوية. إعداد 1٪ (ث / ت) انزيم محلول المنظفات (انظر جدول المواد )، للمساعدة في إزالة الخلايا المتبقية من رقاقة ميكروأري، عن طريق إذابة 1 غرام من مسحوق المنظفات الانزيم في 100 مل من الدافئة (~ 40-45 درجة مئوية) الماء منزوع الأيونات. السماح للحل لتبريد وتخزينها في 4 درجات مئوية وأو حتى سنة واحدة. 2. تعقيم رقائق الشرق الأوسط وأفريقيا (الشكل 1A) ملاحظة: تتوفر عدة تشكيلات مختلفة من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، مع تنسيقات أحادية أو متعددة. بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم ميي غرفة واحدة تحتوي على 60 أقطاب تسجيل في ترتيب شبكة 8 × 8 (انظر جدول المواد ). قطر القطب هو 30 ميكرون والمسافة بين الأقطاب هو 200 ميكرون. كما يوجد إلكترود مرجعي واحد. شطف رقاقة جيدا مع الماء منزوع الأيونات. وضع رقائق الشرق الأوسط وأفريقيا داخل طبق بيتري الزجاج التي يمكن تعقيمها. التفاف الطبق في رقائق الألومنيوم. تعقيم رقائق في طنجرة ضغط المختبر لمدة 6 دقائق. السماح للأطباق لتبريد قبل الافتتاح. ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن تعقيم رقائق عن طريق غمر لهم في 1 مل من 80٪ (الخامس / الخامس) الإيثانول في رت لمدة 15-30 دقيقة. وضع رقائق في غطاء محرك السيارة ثقافة هود وفضحسطح للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة تقريبا. 3. طلاء رقائق الشرق الأوسط وأفريقيا (الشكل 1B و 1 C) وضع رقائق نظيفة داخل معيار 10 سم Ø البلاستيك طبق بتري العقيمة. إضافة 8 مل الماء المقطر العقيمة إلى طبق بتري لتشكيل غرفة ترطيب، والتي سوف تمنع حجم صغير من الوسط الثقافي على رقاقة لتجف عند وضعها في الحاضنة. استخدام العرف بوليتترافلورثيلين (بتف) خواتم ( الشكل 1B ) لضمان تصفيح من العضلية في وسط الشريحة، حيث يقع مجموعة الكهربائي. (يتم تخزين حلقات بتف سابقا في الايثانول 80٪). في غطاء محرك السيارة الثقافة، وإزالة حلقات من الإيثانول، ووضعها في طبق بتري العقيمة دون غطاء والسماح للحلقات لتجف في غطاء محرك السيارة. وضع حلقة جافة داخل رقاقة واحدة ميي باستخدام ملاقط اللهب تعقيم ( الشكل 1C ). ملاحظة: بدلا من ذلك استخدام الايثانول 80٪ لغسل ملاقط والسماح لتجف طن غطاء الأنسجة الأنسجة قبل استخدامها. ذوبان الجليد قسامة واحدة من الأسهم المؤتلف البشري فبرونيكتين (200 ميكروغرام / مل في الماء المقطر) وتمييع في برنامج تلفزيوني مع كا 2 + و مغ 2+ للحصول على حل عمل من 40 ميكروغرام / مل. معطف الأقطاب بإضافة 50 ميكرولتر من 40 ميكروغرام / مل فبرونيكتين داخل الحلبة. ملاحظة: طلاء باستخدام فبرونيكتين المؤتلف الإنسان يضمن المرفق هسك-سم الأمثل. ومع ذلك، يمكن استخدام أنواع أخرى من البروتينات طلاء مثل فبرونيكتين البقري أو خلائط البروتينات المصفوفة خارج الخلية. إغلاق غطاء 10 سم Ø البلاستيك طبق بتري ونقل بعناية طبق يحتوي على رقاقة ميي في الحاضنة. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل، أو في 4 درجة كو / N. نقل الطبق الذي يحتوي على رقاقة ميي إلى غطاء الخلية الثقافة. قبل استخدام رقاقة ميي، نضح 50 ميكرولتر من فبرونيكتين باستخدام ماصة P200 أو نظام فراغ في غطاء محرك السيارة، دون تشريد حلقة بتف. استخدام بلانصائح ستيك لهذه الخطوة. تأكد من عدم وجود أشياء صلبة (على سبيل المثال، نصائح ماصة) تلمس داخل الطبق لأن هذا يمكن أن تضر الأقطاب. ملاحظة: هذا سوف يمتد حياة رقائق ميي. إضافة بلطف 950 ميكرولتر من المتوسطة لي-ببيل (انظر الجدول 1 وجدول المواد )، وضمان أن يتم توزيعها بالتساوي وأن الحلقة لا تطفو. عودة الطبق إلى الحاضنة. 4. هسك-كمس التفكك والطلاء (الشكل 2) ملاحظة: بروتوكول هنا وصف يجعل من استخدام هسك-سمس التي كانت متباينة في ثقافة أحادي الطبقة باستخدام السيتوكينات 34 في ~ 18 يوما بعد بدء التمايز. ومع ذلك، فقد ثبت أن تكون مناسبة لأي 2D و 3D هسك-سم الثقافة. عند استخدام الثقافات متباينة في وقت سابق أو وقت لاحق نقطة، وضبط فترة حضانة الانزيم التفكك (انظر جدول المواد ) قد يكون نcessary. والمقصود المجلدات التالية لبئر واحد من شكل لوحة 12 جيدا (3.8 سم 2 ). نضح المتوسطة من ثقافة هسك-سمس جيدا. أثناء العمل تحت غطاء الأنسجة الثقافة، إضافة 1-2 مل / حسنا من برنامج تلفزيوني دون كا 2 + / مغ 2+ لغسل الثقافة. نضح برنامج تلفزيوني. إضافة 500 ميكرولتر / جيدا من انزيم التفكك. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. إضافة 1 مل لي-ببيل / جيدا لتخفيف الإنزيم. فصل بلطف أحادي الطبقة من هسك-كمس عن طريق خدش بلطف باستخدام ماصة P1000. جمع تعليق الخلية في أنبوب 15 مل. شطف جيدا مع 1 ملليلتر لي-ببيل لجمع كل الخلايا المتبقية وتكتلات الخلايا. إضافة آخر 2-3 مل من لي-ببيل للوصول إلى الحجم النهائي من 5-6 مل وبلطف ماصة صعودا وهبوطا 3-5X مع ماصة 5 مل لفصل كتل الخلية. ملاحظة: التفكك في خلايا واحدة في هذه المرحلة ليست ضرورية، لأنها سوف تؤثر على بقاء الخلية. وجود مجموعات صغيرة سوفضمان أعلى بقاء الخلية. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في رت لمدة 3 دقائق في 300 × ز. إزالة طاف، في محاولة لإزالة معظم السوائل الفائض ولكن من دون إزاحة بيليه الخلية. ريسوسبيند الخلية بيليه في 250 ميكرولتر لي-ببيل (باستخدام P1000 و بيبتينغ بلطف للغاية). توزيع ~ 50 ميكرولتر من تعليق خلية في الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف (ما يصل إلى 5 مياس يمكن أن تكون مستعدة من بئر واحد من لوحة 12 جيدا) عن طريق بيبتينغ تعليق الخلية مباشرة في مركز حلقة بتف، على رأس مجموعة الكهربائي. ملاحظة: في هذه المرحلة من الصعب حساب العد بسبب وجود مجموعات الخلايا والعدد الإجمالي للخلايا لكل ميي يمكن أن تختلف إلى حد كبير، اعتمادا على مصدر هسك-سم المستخدمة. في حين الطلاء، والتأكد من أن سحابة من الخلايا المنفصلة تغطي مساحة الأقطاب. نقل بعناية الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية والسماح للخلايا لربط O / N 5. إزالة حلقة و ري المتوسطةطازجة (الشكل 3) في 1 يوم بعد الطلاء، وإزالة بعناية الحلبة في بيئة معقمة باستخدام ملاقط معقمة ( الشكل 3A-3B ). شطف الحلقة في 80٪ (الخامس / الخامس) الإيثانول وتخزينه في أنبوب 50 مل تحتوي على الطازجة 80٪ (الخامس / الخامس) الإيثانول. إزالة بلطف 500 ميكرولتر من المتوسطة من رقاقة ميي وإضافة 500 ميكرولتر من لي-ببيل جديدة. نقل الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: يجب أن تبدأ الخلايا الضرب 1-7 أيام بعد إزالة حلقة والتغير المتوسط ​​( الشكل 3C ). قياس النشاط الكهربائي من هسك-سمس على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف 1-7 أيام بعد إزالة الحلقة. 6. تحقق جودة الإشارة (الشكل 4) التبديل على جهاز الكمبيوتر وإطلاق مجموعة البرامج المرتبطة ميي اقامة: تسكس التحكم، MC_MEA حدد و MC_Rack. تعيين درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية في تسكس التحكم لتسجيل القياسات في درجة الحرارة الفسيولوجية. إزالة الطبق الذي يحتوي على رقاقة ميي وروم الحاضنة. فتح الغطاء، وإخراج رقاقة الشرق الأوسط وأفريقيا، ووضعه على الأنسجة لامتصاص المياه المتبقية. مسح بعناية جهات الاتصال الخارجية من لوحة مع الأنسجة وتنظيفها باستخدام مسحة القطن مبلل مع 100٪ (V / V) الإيثانول لإزالة أي المياه المتبقية أو الحطام، والتي قد تسبب ضوضاء إشارة. نقل لوحة ميي إلى تسخين (37 درجة مئوية) تسجيل رئيس مرحلة للكشف عن النشاط التلقائي (على سبيل المثال، الأجهزة: انظر جدول المواد ؛ البرمجيات: MC_Rack). فتح MC_Rack: انقر فوق 'تحرير' → 'إضافة MC_Card' لإنشاء بروتوكول جديد. استخدام القائمة المنسدلة "تحرير" لإضافة مسجل مختلفة ونوافذ العرض إلى البروتوكول. ملاحظة: يوصى بتكرار أخذ العينات لا يقل عن خز 10. البروتوكول الذي نستخدمه يحتوي على واحد أداة عرض طويل المدى، مع تخطيط كامل للرقاقة ميي كله، واحد سبايك فارز، ضروري لالتقاط تأثير المخدرات طn الوقت الحقيقي. يتم ضبط سبايك كوتوت مع "الزناد مسبق" من 20 مللي ثانية، "الزناد آخر" من 800 مللي ثانية و "الوقت الميت" من 2 مللي ثانية. يمكن حفظ البروتوكول باسم '.rck' ملف وإعادة تحميلها قبل بدء التجارب. بدء تشغيل البروتوكول في وضع اللعب عن طريق النقر على زر "اللعب". ملاحظة: عند هذه النقطة فمن الممكن لإعادة تحميل بروتوكول حفظها تحت الخطوة 6.5. في MC_Rack، قم بتحميل البروتوكول (ملحق ملف .rc) بالنقر فوق 'ملف' → 'فتح'. إذا كانت الإشارات تظهر مرئية بوضوح قمم R و T قمم، والانتظار 10-15 دقيقة لإبرام مرحلة التكيف. وترد أمثلة على آثار نوعية جيدة وسيئة في الشكل 4 . ملاحظة: إذا كان لا يمكن الكشف عن T- الذروة في أي من الأقطاب الكهربائية، لا المضي قدما في التجربة. وعادة ما يكون هذا نتيجة لنشاط كهربائي ضعيف من هسك-سمس أو ضعف التعلق من الخلايا إلى الأقطاب الكهربائية. 7. ابدأ إكسبيريمنت والتسجيل انقر فوق "سجل" ثم "اللعب"، والحصول على البيانات لمدة 10 دقيقة في ظل ظروف خط الأساس لتحديد حالة مستقرة. علق الأقطاب التي لديها أفضل إشارة بحيث يمكن التعرف عليها بسهولة وتصديرها في وقت لاحق للتحليل. لتقييم الاستجابة للأدوية، إضافة تركيزات متزايدة من المخدرات في كل 10 دقيقة. على سبيل المثال، إضافة هيرغ مانع E4031 في تركيز النهائي من 1 ميكرومتر. لهذا، إزالة 100 ميكرولتر من المتوسطة وإضافة نفس حجم 10 ميكرومتر E4031 الذائبة في المتوسط. ملاحظة: كما أظهر سابقا من قبل كافيرو وزملاؤه 31 ، خيارا حكيما من حجم الذي يتم حل الأدوية مهم، لأنه يمكن أن يغير عميقا منحنى استجابة الدواء. كرر الخطوة 7.2 لجميع تركيزات الدواء الأخرى من الفائدة. انقر فوق "إيقاف" لإبرام التسجيلات في نهاية البروتوكول. 8.ميي تنظيف لإعادة الاستخدام بمجرد الانتهاء من تسجيل التجربة، إزالة بلطف وسط مع ماصة P1000. لا تلمس الداخل من الطبق لأن هذا يمكن أن تضر الأقطاب. تجاهل وفقا لقواعد السلامة المحلية. شطف رقائق ميي مع الماء منزوع الأيونات باستخدام زجاجة غسل، وكرر الخطوة غسل 3-4X. ملاحظة: في هذه المرحلة ليس من الضروري أن الخلايا منفصلة تماما من رقاقة. إضافة 1 مل من محلول المنظفات الانزيم 1٪ (الخامس / الخامس) في كل بئر واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية للسماح انفصال الخلية وإزالة الخلية. بعد يوم واحد، وشطف رقائق الشرق الأوسط وأفريقيا جيدا مع الماء منزوع الأيونات لإزالة محلول المنظفات الانزيم والخلايا المتبقية وإضافة 1 مل منزوع الأيونات الماء. يمكن تخزين رقائق ميي نظيفة مغمورة في الماء منزوع الأيونات في 4 درجات مئوية. 9. تصدير البيانات افتح برنامج MC_Data تول المرتبط ببرنامج ميي. انقر فوق 'ملف' → 'فتح ماكد'. انقر فوق "أدوات" → "تحويل مسد إلى أب" . حدد الأقطاب مع أفضل إشارات تسجيل ليتم تصديرها للتحليل. اختر الدليل الذي لحفظ الملفات التي تم تصديرها ثم انقر فوق "حفظ". قد يستغرق إجراء التصدير عدة دقائق اعتمادا على عدد من الأقطاب المصدرة والحجم الكلي للملفات التسجيل. 10. تحليل البيانات تحميل وتثبيت الحصول على البيانات الكهربية وتحليل البرنامج (على سبيل المثال، كلامب). مرة واحدة كاملة، وإطلاق برامج التحليل (على سبيل المثال، كلامبيت). ر الفاصلة حساب (الشكل 5). ضع مؤشرين رأسيين لتحديد المنطقة ذات الاهتمام على التتبع. حدد "اكتشاف الأحداث" → "بحث عتبة". المؤشر الأفقي يجب عبور جميع الأحداث التي يجب أن يكون كميا، كما هو مبين في الشكل 5A . انقر &# 39؛ موافق "، ثم" قبول الفئة الكاملة ". سيقوم البرنامج ثم البحث من خلال تتبع لجميع الأحداث المناسبة. سيتم وضع علامات زرقاء فوق الأحداث. ضبط حساسية التحديد التلقائي عن طريق ضبط المعلمات في إطار الكشف عن الحدث الرئيسي. مرة واحدة وقد تم تحديد جميع الأحداث تلقائيا، انتقل إلى نافذة النتيجة (نافذة → النتائج) ونسخ العمود المعنون "الفاصل الزمني التدخل"، والذي يحتوي على بيانات تردد ( الشكل 5B ). كت الفاصل الزمني الحساب (أرقام 6-9): وضع مؤشر واحد الحق قبل واحد بعد فب واحد في حالة حالة مستقرة. حدد "اكتشاف الحدث" → "إنشاء قالب" ( الشكل 6 ) . تحقق من تحديد فب بشكل صحيح وانقر فوق "إضافة". سيتم نقل النموذج إلى اللوحة السفلية. حفظ القالب ك ".atf"ملف. وبهذه الطريقة، تم إنشاء تتبع قالب التي سيتم بحثها من قبل البرنامج في جميع أنحاء تسجيل كامل ( الشكل 7 ). إنشاء قالب واحد لكل حالة، لأن تأثير الدواء قد يغير شكل فب. إذا لزم الأمر، قم بتصفية التتبع قليلا ليشمل حد أقصى قدره 10.000 نقطة داخل المؤشرين. مرة واحدة تم حفظ القالب مع ملحق '.atf'، حدد 'كشف الحدث' → 'البحث قالب' وتحميل القالب. اضبط "عتبة تطابق القالب" لتحديد كل فب بشكل صحيح في الفاصل الزمني المحدد. مرة واحدة تم تحديد كافة الأحداث بشكل صحيح، حفظها في ملف '.abf' جديد. فتح الملف مع برنامج التحليل وحساب تلقائيا "وقت الذروة" لكل من Q / R و T قمم ( أرقام 8، 9 ). إذا كانت آثار صاخبة جدا، وتطبيق مرشح. احسب الفاصل الزمني كيو تي بطرحقيمة Q / R من قيمة T في محرر جدول بيانات من الاختيار.

Representative Results

بعد يوم واحد من التفكك والطلاء، وطبقة من هسك-سمس تكون مرئية كما فيلم كثيف والأبيض تغطي مركز غرفة الشرق الأوسط وأفريقيا ( الشكل 3A ). بعد إزالة الحلبة ( الشكل 3B )،   يجب أن تبقى طبقة في مكان والتفتيش على المجهر الضوئي سوف تظهر الأقطاب ميي التي تغطيها (المتعاقد) طبقة هسك-سم ( الشكل 3C ). بسبب اقتران الفيزيائي والكهربائي للخلايا، وسيتم استخدام قطب واحد فقط (القطب الذهبي) للتحليل. بدلا من ذلك، عند العمل مع الهياكل 3D، مثل الأجسام الجنينية أو ميكروتيسس، يمكن أن تكون مطلية بحيث تكون جسديا وكهربائيا أونكوبلد. الفحص البصري في المجهر يمكن تأكيد أي اتصال مادي بين المجموعات والموجات R غير المتزامنة في الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف لا تأكيد اقتران الكهربائية. في هذا ج آس، يمكن تحليل أقطاب مستقلة متعددة. وتظهر التسجيلات النموذجية للتتبع فب في الشكل 4 . على وجه الخصوص، يمكن تحديد أثر نوعية جيدة من خلال وجود ذروة واضحة المقابلة لتدفق نا + والغشاء الاستقطاب (R / Q الذروة)، مرحلة إعادة الاستقطاب واضحة المقابلة ل K + تدفق (T الذروة)، وارتفاع إشارة إلى نسبة الضوضاء ( الشكل 4A ، اليسار: لاحظ مقياس ص المحور والشكل 4B ). آثار نوعية سيئة ( الشكل 4A ، وسط) قد يكون نتيجة لفشل هسك-سمس لإرفاق لوحة ميي أو ضعف النشاط الكهربائي هسك-سم. الانتظار 1-3 أيام لمرفق أفضل قد يحسن إشارة؛ ومع ذلك، إذا لم يكن هناك تحسن إشارة مرئية، باستثناء هذا الاتفاق البيئي المتعدد الأطراف من التجارب يوصى. آثار صاخبة ( الشكل 4A ، يمين) يمكن تحليلها بعد التصفية. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-بادج = "1"> يمكن تحديد التحليل الناجح للفاصل ر من خلال الفحص البصري للشاشة تظهر الكشف الذروة ( الشكل 5A، 5B ). ضمن الفاصل الزمني المحدد من قبل المؤشرات الرأسية، يجب أن تكون العلامات الزرقاء المقابلة لكل ذروة موجودة. في حالة عدم تحديد برنامج واحد أو أكثر قمم، في محاولة لتحريك المؤشر الأفقي وتشغيل التحليل مرة أخرى أو ضبط إعدادات الكشف. وبالمثل، يمكن تحديد التحليل الناجح للفاصل كت من خلال الفحص البصري للشاشة تظهر الكشف عن فب ( الشكل 7 ). ضمن الفاصل الزمني المحدد من قبل المؤشرات الرأسية، يجب أن تكون العلامات الزرقاء المقابلة لكل كشف فب موجودة. في حالة عدم تحديد البرنامج واحد أو أكثر فبس، في محاولة لإعادة تعريف قالب فب ( الشكل 6 ) أو ضبط إعدادات الكشف وتشغيل التحليل مرة أخرى. المستخرجات الفردية فب آثار أو متوسطها ( الشكله 8) يمكن استخدامها للحصول على قيم الفاصل الزمني كت مع إعدادات محددة كما هو الحال في الشكل 9 . تحليل العلاقة بين كت-ر من المستحسن وذات مغزى في خطوط هسك المريضة وت ( الشكل 10A ) وتقييم الحاجة و / أو تأثير التصحيحات الفاصلة كت ( الشكل 10B-10D ). هسك-سمز تحمل الطفرات تسبب لكتس لفترات طويلة كيو تي مقارنة مع الضوابط وت ( الشكل 11A ). علاج هسك-سمز مع نتائج مانع هيرغ في كت الفاصل إطالة ( الشكل 11B ). على العكس من ذلك، والعلاج مع المنشطات هرغ النتائج في تقصير الفاصل كت ( الشكل 11C ). وأخيرا، ينبغي أن يكون العلاج بالعقاقير التي تؤثر على تردد الضرب من هسك-سمس مرئيا كتغيير في الفاصل الزمني ر ( الشكل 11D، وتقصير الفاصل الزمني ر). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55587/55587fig1.jpg" /> الشكل 1: التعقيم والطلاء من رقائق ميي. ( A ) مخطط يمثل عملية التعقيم بما في ذلك وضع رقاقة الشرق الأوسط وأفريقيا في أوتوكلافابل الزجاج طبق بتري، التفاف في رقائق الألومنيوم، تبخير لمدة 6 دقائق، وتعريض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. ( B ) أعلى (اللوحة اليسرى) والجانب (لوحة الأوسط) وجهات النظر من خاتم بتف مخصصة. الحلبة قطرها الخارجي 1.2 سم، بما في ذلك 4 اللوحات التي تسمح لتحديد المواقع في وسط رقاقة الشرق الأوسط وأفريقيا والقطر الداخلي هو 0.4 سم (اللوحة اليمنى). ( C ) تخطيطي يمثل إعداد رقاقة ميي بما في ذلك وضع رقاقة في طبق بيتري البلاستيك القياسية، مضيفا 8 مل من الماء منزوع الأيونات خارج غرفة الشرق الأوسط وأفريقيا، ووضع حلقة بتف في منتصف الغرفة، وطلاء مجموعة القطب مع فبرونيكتين . بعد فترة الحضانة، تتم إزالة فبرونيكتين واستبدالها مع المتوسطة الثقافة.t = "_ بلانك"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: التفكك والطلاء من هسك-سمس. التخطيطي يمثل عمليات هسك-سمز التفكك الأنزيمية، الطرد المركزي، إعادة تعليق، والطلاء على مركز غرفة الشرق الأوسط وأفريقيا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: رقائق ميي مع طبقة هسك-سم. ( A ) أعلى وجهات النظر من ميي رقاقة تحتوي على حلقة وطبقة من هسك-سمس. ( B ) منظر الجانب من ميي رقاقة بعد إزالة الحلقة. ( C ) صورة حقل مشرق من هسك-سمس طبقة مطلي على الصغرى-مجموعة القطب؛ 4X التكبير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: تسجيل ميي من هسك-سمس. ( A ) آثار الممثل المسجلة مع ميي تظهر أثر نوعية جيدة مع R / Q و T قمم واضحة للعيان مع إشارة عالية إلى نسبة الضوضاء (يسار)، تتبع نوعية سيئة دون واضحة واضحة R / Q و T قمم (الوسط)، وتتبع صاخب مع R / Q و T قمم واضحة للعيان ولكن مع إشارة منخفضة إلى نسبة الضوضاء (يمين). ( B ) أمثلة ممثلة من نوعية جيدة فب يتتبع مع مورفولوجيز مختلفة التي يمكن تسجيلها خلال التجارب ميي باستخدام هسك-سمز. وتمثل المنطقة المظللة الفاصل الزمني كيو تي المقاس أثناء التحليل. بما أن فب في ميي يشبه أول المشتقاته من إمكانات العمل 28 ، قمنا بحساب تكامل تتبع فب، كما هو موضح الخط الأحمر منقط، كما مظاهرة النظرية من اختيار موجة T على مقربة من عمل إعادة الاستقطاب المحتملة كاملة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: حساب الفاصل الزمني للخدمة الراديوية. ( A ) مثال على تحليل الفاصل الزمني لل ر مع الكشف التلقائي الذروة (أعلى) واستخراج البيانات (أسفل) باستخدام برنامج التحليل (انظر جدول المواد). تحدد المؤشرات الرأسية الفاصل الزمني الذي يهمك الاهتمام، ويعبر المؤشر الأفقي عن جميع الأحداث التي يتم اكتشافها وتحديدها بواسطة العلامات الزرقاء. ( B ) يوضح العمود المكبر البيانات المستخرجة المستخدمة لحساب الفاصل الزمني للوصلة الراديوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 6: إنشاء قالب فب. مثال على اختيار القالب باستخدام المؤشرات الرأسية وضعت قبل وبعد فب واحد. يتم استخدام هذا القالب لتحديد تلقائي فب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشکل 7: القیاس التلقائي للقالب فب. مثال على بحث القالب خلال فاصل زمني محدد بواسطة مؤشرين رأسيين. يتم تحديد كافة الأحداث الكشف عن طريق علامات زرقاء وتكون أوتوماتيكالذ فرضه في أقحم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 8: التحديد الكمي لمعلمات فب. تحليل الأحداث المحفوظة، مع ذروة R تحديدها يدويا ضمن أول اثنين من المؤشرات و T الذروة التي تم تحديدها يدويا ضمن المؤشرين الماضيين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 9: نافذة التحليل. المعلمات المستخدمة في إطار الإحصاءات للكشف عن R الذروة. للكشف عن الذروة T، تغيير المؤشرات و (إذا لزم الأمر) بوlarity. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 10: علاقة كت-ر. ( A ) مثال على علاقة مختلفة بين كت وفترات ر بين وت (LQT1 كور ) ونوع متلازمة كت طويلة 1 (LQT1 R190Q ) هسك – سم . وتظهر المناطق المظللة أن نفس التحول في الفاصل الزمني ر يولد تحولا أكبر في الفاصل كت من الخط المريضة LQT1، وبالتالي احتمال زيادة عدم انتظام ضربات القلب قابلية. ( B ) العلاقة بين فواصل كت غير مصححة وفترات الترددات الراديوية المقيسة في الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف بمجموعات من خطوط هسك مختلفة. يظهر تأثير تصحيح كت لصيغ بازيت ( C ) أو فريدريسيا ( D ) ويظهر كالتغير في منحدر كت-ر في العلاقة الطرفية. الأرقام التي تم تكييفها من المرجع 30 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 11: الاختلافات الفاصلة بين كت والفترة الزمنية التي يسببها المرض. ( A ) مثال على إطالة فترة كت في هسك-سم المستمدة من مريض يحمل طفرة طويلة متلازمة (كتس) طفرة بالمقارنة مع السيطرة وت إيسوجينيك. ( ب ) مثال على إطالة فترة كت في هسك-سم على كتلة هرغ الدوائية. ( C ) كت الفاصل الزمني على العلاج مع زيادة جرعات المنشط هيرغ. السهم يشير إلى اتجاه السمن. ( D ) مثال على تقصير الفاصل الزمني ر. تم تكييف لوحة (C) من المرجع> 30. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. منخفض الأنسولين، بسا، كحول بولي فينيل، الدهون الأساسية (لي-ببيل) متوسطة مكون الكمية ل 100 مل IMDM 43 مل F12 43 مل حمض الأسكوربيك 2-فوسفات (5 ملغ / مل في الماء المقطر) 1 مل خلية تكملة ثقافة (بديل مباشر ل L- الجلوتامين) 1 مل البنسلين / الستربتوميسين 0.5مل الفينول الأحمر 1 ملغ بروتين فري هبريدوما مديوم-إي (بفمي) 5 مل بسا (10٪ بالوزن / فول في إدم) 2.5 مل بفا (5٪ بالوزن / فول في الماء المقطر) 2.5 مل التركيز الكيميائي للشفاه (دلك) 1 مل الأنسولين-ترانسفيرين-السيلينيوم-الإيثانولامين (إيتس-X) 100X 0.1 مل α-مونوثيوغليسيرول (13 ميكرولتر في 1 مل إمدم) 0.3 مل الجمع بين الكواشف، تصفية مع فلتر المسام 0.22 ميكرون وتخزين المتوسطة في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع. الجدول 1: لي-ببيل التكوين المتوسط.

Discussion

يوضح هذا البروتوكول كيفية فصل وإعداد هسك-سمس لقياس فب باستخدام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. هسك-سمس عادة ما يعرض النشاط الكهربائي العفوي، والتي يمكن قياسها كما فب ويمكن أن توفر بيانات ذات مغزى فيما يتعلق تردد الضرب، مدة الفاصل كت، والأحداث عدم انتظام ضربات القلب.

هناك حاجة إلى التفكك من الثقافات متباينة القلب 2D لإعادة طبقة الضرب على الشرق الأوسط وأفريقيا ويمثل خطوة حاسمة. الإجهاد الميكانيكي عن طريق بيبتينغ المتكررة و / أو العلاجات الانزيم العدوانية التفكك قد يؤدي إلى ارتفاع معدل وفيات الخلايا، وعدم ربط إلى لوحة ميي، وعدم وجود نشاط كهربائي عفوية. وقد تم تحسين هذا البروتوكول لثقافات أحادي الطبقة. ومع ذلك، يمكن استخدام نهج مماثل لثلاثية الأبعاد (3D) الثقافات (على سبيل المثال، الأجسام الجنينية أو إبس) مع تعديلات طفيفة، مثل جمع إبس تليها غسل برنامج تلفزيوني وقتا أطول حضانة مع انزيم ديسوسياتينغ. استيرادفي كل من الثقافات متباينة 2D و 3D، وكبار السن خلايا متباينة، وقتا أطول الحضانة المطلوبة قد يكون لفصل الخلايا بسبب زيادة ترسب المصفوفة خارج الخلية.

بروتوكول الموصوفة هنا لقياس المعلمات فب يمكن استخدامها لتوليد منحنيات الجرعة والاستجابة للأدوية كارديواكتيف. كما وصفها مؤخرا كافيرو وآخرون. 31 ، وتركيز البداية للدواء قد تؤثر تأثيرا عميقا على نتيجة قياس ميي. لذلك، لتحسين دقة وموثوقية النتائج، نقترح ما يلي: 1) في حالة المنشطات / حاصرات لا رجعة فيه، واستخدام كميات كبيرة نسبيا من المتوسطة التي تحتوي على المخدرات لفحصها. أكثر تفصيلا، وإزالة 10-50٪ من حجم متوسط ​​من رقاقة ميي وإضافة حجم مساو من المتوسطة التي كان يذوب في السابق الدواء في التركيز المناسب. في هذه الحالة، لحساب تركيز الدواء النهائي، فمن الأهمية بمكان للنظر فيهاإيه التغيير في التركيز بعد إزالة المتوسطة. 2) في حالة المنشطات عكسها / حاصرات، إضافة 10 ميكرولتر من كل جرعة الدواء من حل الأسهم 100X.

الغالبية العظمى من بروتوكولات التمايز القلب ينتج في متفاوتة السكان المختلطة من العقيدات مثل الأذيني والبطين مثل عضلات القلب، مع نوع البطين كونها الأكثر تمثيلا. وهذا قد يشكل قيودا عند نمذجة أمراض القلب التي تؤثر على نوع فرعي كارديوميوسيت محددة أو الأدوية التي تعمل على قنوات أيون النوع الفرعي للقلب. على الرغم من أن العديد من الدراسات قد الأمثل الظروف لتوجيه مواصفات أكثر رقابة خلال التمايز القلبي 3 ، 5 ، 37 ، 38 ، تطبيقها على نطاق أوسع لا يزال قيد التحقيق.

وعلاوة على ذلك، كفاءة متفاوتة من التمايز (في تجارب مختلفة وفي ديخطوط هسك ففيرنت) قد يلاحظ 39 ، 40 ، 41 ، 42 ، 43 ، 44 . استراتيجيات كارديوميوسيت إثراء على أساس التعبير بروتين السطح 35 ، 45 (عن طريق الفرز بمساعدة خلية فلورزنس أو عن طريق اختيار حبة المغناطيسي 46 ، 47 )، واختيار الأيض 44 ، 48 قد تمثل استراتيجيات صالحة يمكن تطبيقها على أي (المعدلة وراثيا أو غير المعدلة) hpsc– خط الطلاء المسبق من هسك-سمس، لتحسين إشارة كهربائية.

على الرغم من أن هسك-سمس غير ناضجة جدا بالمقارنة مع كارديوميوسيتس الكبار الإنسان 4 ، 49 ، وقد ثبت أن تكون قيمة في r(على سبيل المثال ، في أمراض القناة) 19 ، 20 ، 50 والاستجابات التي يسببها المخدرات (على سبيل المثال، حاصرات قنوات أيون القلب) 4 ، 51 . وعلاوة على ذلك، الخلايا غير الناضجة هي أسهل للفصل، واسترداد أفضل من العضلية كارديوميوسيس الكبار بعد التفكك والطلاء 44 وبالتالي، قد يكافأ عدم نضج هسك-سم كميزة في هذا الصدد. ومع ذلك، لتكون قادرة على تلخيص على سبيل المثال . في وقت متأخر ظهور أمراض القلب واستنساخ بأمانة ردود المخدرات من كارديوميوسيتس الكبار، وينبغي الحصول على أكثر نضجا الميكانيكية، والتمثيل الغذائي، والكهربائية هسك-سم الدولة. طرق لتنضج تشمل هذه الخلايا وقتا طويلا في الثقافة 52 ، سلالة الميكانيكية 53 ، سرعة الكهربائية 54 ، إضافة صغيرةجزيئات 55 ، 3D الثقافة 56 ، شارك في الثقافة مع أنواع الخلايا الأخرى 57 ، وحتى مزيج من هذه النهج 58 ؛ حتى الآن، أي من هذه النهج أدت إلى النمط الظاهري مثل الكبار.

كجزء من ميزات عدم النضج، هسك-سمس تظهر التلقائية الكهربائية. وهنا، ترد تفاصيل عن كيفية التحديد الدقيق لقطتي كيو تي و ر. أحد القيود على قياس النشاط الكهربائي العفوي هو أن المقارنة بين فترات كت قد تكون صعبة عندما يعرض هسك-سمس ترددات الضرب المختلفة. في هذه الحالة، يمكن استخدام صيغ بازيت أو فريدريسيا لتصحيح فاصل كت للتردد. ومع ذلك، وكما ذكر سابقا 30 ، ونحن نوصي بشدة إجراء تحليل الانحدار محور الرئيسية عن طريق التآمر فاصل كت مقابل فاصل ر لكل من البيانات الخام وتصحيحها، لاستبعاد أي تحيز ممكن بسبب طريقة التصحيح نفسها.

بروتوكول المقدمة هنا، جنبا إلى جنب مع الأساليب المذكورة سابقا 59 ، 60 يساعد على توحيد الإجراءات وتحليل هبس-سم فبس، وتحسين استنساخ البيانات والسماح بمقارنة أفضل للنتائج بين المختبرات.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد حظي هذا العمل بدعم من المنح التالية: مبادرة البحوث القلبية الوعائية في هولندا (مؤسسة القلب الهولندية، والاتحاد الهولندي للمراكز الطبية للجامعة، والمنظمة الهولندية للبحوث الصحية والتنمية، وأكاديمية العلوم الملكية الهولندية)؛ مجلس البحوث الأوروبي (إركادج 323182 ستيمكارديوفاسك). نشكر E. جياكوميلي (لومك) للمساعدة في التمايز القلب هسك.

Materials

Biological safety cabinet/laminar flow hood Cleanair
MEA2100 in vitro recording system Multi Channel Systems
CO2 cell culture incubator Sanyo MCO-15A
Centrifuge Hitachi himac-CT6EL
Leica stereomicroscope Leica Microsystems MS5
Handheld pipetman (P-10 (10μL), P-200 (200μL), P-1000 (1000μL)) Gilson International
Filter tips (10 μL, 200μL, 1000μL) Corning 4807 (10 μL), 4810 (200μL), 4809 (1000μL)
Disposable bottle top filter (0.22 μm pore size) Millipore SCGVU02RE
Sterile plastic pipette Greiner Bio-One 606180 (5 mL), 607180 (10 mL), 760180 (25 mL)
Tweezers Dumont
Autoclavable Petri dishes VWR/ Duran Group 391-0860
MEA chip Multi Channel Systems MEA200/30iR-Ti-gr
Phosphate-Buffered Saline (PBS) calcium, magnesium Thermo Fisher Scientific 14040-091
Phosphate-Buffered Saline (PBS) no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190-169
Human recombinant fibronectin Tebu-Bio J64560
Custom made polytetrafluoroethylene (PTFE) MEA rings LUMC: department of Instrument Development
Dissociation enzyme – TrypLE Select 1X Thermo Fisher Scientific 12563-029
Tergazyme enzyme detergent Sigma-Aldrich Z273287-1EA
Distilled Water Thermo Fisher Scientific 15230-089
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for LI-BPEL medium
IMDM Thermo Fisher Scientific 21056-023
F12 Thermo Fisher Scientific 31765-027
Ascorbic Acid 2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Glutamax Thermo Fisher Scientific 35050-038
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070-063
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Protein Free Hybridoma Medium-II (PFHMII) Thermo Fisher Scientific 12040-077
Bovine Serum Albumin (BSA) Bovogen Biologicals Australia BSAS05
Poly(vinyl alcohol) (PVA) Sigma-Aldrich P8136
Chemically Defined Lipid Concentrate (CDLC) Thermo Fisher Scientific 11905-031
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X) 100X Thermo Fisher Scientific 51599-056
α-Monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
Name Company Software version Comments
MC_Rack Multi Channel Systems 4.6.2 Alternatively, data can be recorded using Cardio2D or MC_Experimenter (MultiChannel Systems)
TCX Control Multi Channel Systems 1.3.4
MEA Select Multi Channel Systems 1.3.0
MC_Data Tool Multi Channel Systems 2.6.15 Alternatively, Multi Channel Data Manager (MultiChannel Systems) can be used when custom data export is required (HDF5, EDF, etc.)
Clampfit Molecular Devices 7.0.0 Used in step 10.1 for analyzing, graphing, and formatting of all of data. To use Clampfit, download and install the electrophysiology data acquisition and pClam (latest version, 10.7.0), available on the Molecular Devices Website. Once complete, launch the software Clampfit. Alternatively, data can be analysed using Cardio2D (MultiChannel Systems) or MatLab custom code.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  3. Birket, M. J., et al. Expansion and patterning of cardiovascular progenitors derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (9), 970-979 (2015).
  4. Denning, C., et al. Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1728-1748 (2016).
  5. Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7 (4), 394-410 (2015).
  6. Lewandowski, J., Kolanowski, T. J., Kurpisz, M. Techniques for the induction of human pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. J Tissue Eng Regen Med. , (2016).
  7. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  8. Davies, M. P., An, R. H., Doevendans, P., Kubalak, S., Chien, K. R., Kass, R. S. Developmental changes in ionic channel activity in the embryonic murine heart. Circ Res. 78 (1), 15-25 (1996).
  9. Bellin, M., et al. Isogenic human pluripotent stem cell pairs reveal the role of a KCNH2 mutation in long-QT syndrome. EMBO J. 32 (24), 3161-3175 (2013).
  10. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  11. Ma, D., et al. Modeling type 3 long QT syndrome with cardiomyocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells. Int J Cardiol. 168 (6), 5277-5286 (2013).
  12. Yazawa, M., et al. Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome. Nature. 471 (7337), 230-U120 (2011).
  13. Limpitikul, W. B., et al. A Precision Medicine Approach to the Rescue of Function on Malignant Calmodulinopathic Long QT Syndrome. Circ Res. , (2016).
  14. Liang, P., et al. Patient-Specific and Genome-Edited Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Elucidate Single-Cell Phenotype of Brugada Syndrome. J Am Coll Cardiol. 68 (19), 2086-2096 (2016).
  15. Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Mol Med. 4 (3), 180-191 (2012).
  16. Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. J Cell Mol Med. 16 (3), 468-482 (2012).
  17. Bellin, M., Mummery, C. L. Inherited heart disease – what can we expect from the second decade of human iPS cell research. FEBS Lett. 590 (15), 2482-2493 (2016).
  18. Sallam, K., Li, Y., Sager, P. T., Houser, S. R., Wu, J. C. Finding the rhythm of sudden cardiac death: new opportunities using induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 116 (12), 1989-2004 (2015).
  19. Sinnecker, D., Goedel, A., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: a versatile tool for arrhythmia research. Circ Res. 112 (6), 961-968 (2013).
  20. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient?. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
  21. Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacol Ther. 143 (2), 246-252 (2014).
  22. Terrenoire, C., et al. Induced pluripotent stem cells used to reveal drug actions in a long QT syndrome family with complex genetics. J Gen Physiol. 141 (1), 61-72 (2013).
  23. Abi-Gerges, N., et al. Assessment of extracellular field potential and Ca2+ transient signals for early QT/pro-arrhythmia detection using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Pharmacol Toxicol Methods. 83, 1-15 (2016).
  24. Del Alamo, J. C., et al. High throughput physiological screening of iPSC-derived cardiomyocytes for drug development. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1717-1727 (2016).
  25. Blinova, K., et al. Comprehensive Translational Assessment of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes for Evaluating Drug-Induced Arrhythmias. Toxicol Sci. , (2016).
  26. Nerbonne, J. M. Studying cardiac arrhythmias in the mouse–a reasonable model for probing mechanisms?. Trends Cardiovasc Med. 14 (3), 83-93 (2004).
  27. Halbach, M., Egert, U., Hescheler, J., Banach, K. Estimation of action potential changes from field potential recordings in multicellular mouse cardiac myocyte cultures. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 271-284 (2003).
  28. Tertoolen, L. G., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochem Biophys Res Commun. , (2017).
  29. Rajamohan, D., et al. Automated Electrophysiological and Pharmacological Evaluation of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25 (6), 439-452 (2016).
  30. Sala, L., et al. A new hERG allosteric modulator rescues genetic and drug-induced long-QT syndrome phenotypes in cardiomyocytes from isogenic pairs of patient induced pluripotent stem cells. EMBO Mol Med. 8 (9), 1065-1081 (2016).
  31. Cavero, I., Guillon, J. M., Ballet, V., Clements, M., Gerbeau, J. F., Holzgrefe, H. Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay (CiPA): Pending issues for successful validation and implementation. J Pharmacol Toxicol Methods. , (2016).
  32. Sala, L., Bellin, M., Mummery, C. L. Integrating cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in safety pharmacology: has the time come?. Br J Pharmacol. , (2016).
  33. Chen, I. Y., Matsa, E., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells: at the heart of cardiovascular precision medicine. Nat Rev Cardiol. 13 (6), 333-349 (2016).
  34. Dambrot, C., et al. Strategies for rapidly mapping proviral integration sites and assessing cardiogenic potential of nascent human induced pluripotent stem cell clones. Exp Cell Res. 327 (2), 297-306 (2014).
  35. Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8 (12), 1037-1040 (2011).
  36. Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nat Protoc. 3 (5), 768-776 (2008).
  37. Karakikes, I., et al. Small molecule-mediated directed differentiation of human embryonic stem cells toward ventricular cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (1), 18-31 (2014).
  38. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21 (4), 579-587 (2011).
  39. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107 (21), 2733-2740 (2003).
  40. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108 (3), 407-414 (2001).
  41. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  42. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  43. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8 (1), 162-175 (2013).
  44. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  45. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  46. Fuerstenau-Sharp, M., et al. Generation of highly purified human cardiomyocytes from peripheral blood mononuclear cell-derived induced pluripotent stem cells. PLoS One. 10 (5), e0126596 (2015).
  47. Schwach, V., Passier, R. Generation and purification of human stem cell-derived cardiomyocytes. Differentiation. 91 (4-5), 126-138 (2016).
  48. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  49. Veerman, C. C., Kosmidis, G., Mummery, C. L., Casini, S., Verkerk, A. O., Bellin, M. Immaturity of human stem-cell-derived cardiomyocytes in culture: fatal flaw or soluble problem?. Stem Cells Dev. 24 (9), 1035-1052 (2015).
  50. Karakikes, I., Ameen, M., Termglinchan, V., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: insights into molecular, cellular, and functional phenotypes. Circ Res. 117 (1), 80-88 (2015).
  51. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).
  52. Otsuji, T. G., Minami, I., Kurose, Y., Yamauchi, K., Tada, M., Nakatsuji, N. Progressive maturation in contracting cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: Qualitative effects on electrophysiological responses to drugs. Stem Cell Res. 4 (3), 201-213 (2010).
  53. Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35 (9), 2798-2808 (2014).
  54. Lieu, D. K., et al. Mechanism-based facilitated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Arrhythm Electrophysiol. 6 (1), 191-201 (2013).
  55. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
  56. Mannhardt, I., et al. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. , (2016).
  57. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
  58. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  59. Clements, M. Multielectrode Array (MEA) Assay for Profiling Electrophysiological Drug Effects in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Curr Protoc Toxicol. 68 (22), 1-22 (2016).
  60. Harris, K. A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte (hiPSC-CM) Multielectrode Array Assay for Preclinical Cardiac Electrophysiology Safety Screening. Curr Protoc Pharmacol. 71, 1-15 (2015).

Tags

Pluripotent Stem Cell-derived CardiomyocytesMulti-electrode ArraysElectrophysiological AnalysisField PotentialDrug ScreeningDissociationCell PlatingFibronectin CoatingPTFE RingLI-BPEL Medium

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sala, L., Ward-van Oostwaard, D., Tertoolen, L. G. J., Mummery, C. L., Bellin, M. Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (123), e55587, doi:10.3791/55587 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image