Isolamento Droplet per l'analisi quantitativa dei lipidi Spettrometria di Massa

Goccioline lipidiche sono altamente dinamici organelli cellulari citoplasmatiche (e nucleari) composte da un nucleo di lipidi neutri (trigliceridi (TG) e esteri del colesterolo (CE)) racchiusa da un monostrato di fosfolipidi con proteine incorporate ^1. Tutti i tipi di cellule producono goccioline lipidiche, ma sono di dimensioni variabili, composizione lipidica, e la decorazione delle proteine. goccioline lipidiche svolgono diverse funzioni, tra cui quella di serbatoi di energia e precursori membrana o come depositi di proteine. Inoltre, attraverso l'assorbimento dei lipidi, proteggono le cellule da lipotossicità, lipidi rilascio come molecole di segnalazione, e sono coinvolti nella degradazione delle proteine e reticolo endoplasmatico (ER) di stress risposte ^2. Come tale, una serie di proteine ​​si legano a gocce lipidiche e governare la loro generazione, il degrado, il traffico, e l'interazione con altri organelli. Tra loro ci sono la famiglia perilipin di buona fede proteine leganti dei lipidi delle gocce (PLIN1-5)f "> 3.

Lipidi droplet biogenesi probabile inizia al ER, in cui gli enzimi ER residente catalizzano la sintesi dei lipidi neutri che si accumulano all'interno del doppio strato di membrana, formando una lente di lipidi neutri, un processo che è stato recentemente visualizzato bene in lievito ^4. Membrana piegatura e livelli elevati di acido e diacilglicerolo fosfatidici vengono quindi pensato di ottenere proteine coinvolte nella biosintesi dei fosfolipidi, come la sintesi simultanea di lipidi neutri core e fosfolipidi schermatura necessaria per la generazione dei lipidi droplet ^5. Gli enzimi che ospitano domini transmembrana che risiedono presso il pronto soccorso catalizzano questo processo. Espansione a grandi goccioline lipidiche richiede l'attività di una diversa classe di enzimi lipidi sintetizzare che ospitano un'elica anfipatica e possono quindi viaggiare dal ER goccioline lipidiche. La mobilitazione dei lipidi dal goccioline lipidiche avviene attraverso l'attivazione locale del triglicerideee diacilglicerolo lipasi lipasi adiposo trigliceridi (ATGL) e ormone-sensibile lipasi (HSL) oppure differenti vie autofagici, come macro e microlipophagy o autofagia ⁶ chaperone-mediata. Goccioline lipidiche interagiscono con altri organelli cellulari, come i mitocondri (per beta-ossidazione e sintesi dei lipidi) e ER (per la sintesi dei lipidi e proteina trafficking), ma anche con i lisosomi, endosomi, e vacuoli intracellulari indotte da batteri ^7. Infatti batteri, virus, parassiti e persino indirizzare goccioline lipidiche per la replica e persistenza, tra i quali HCV ^8.

L'infezione da HCV è una delle principali cause di morbilità correlata al fegato e la mortalità in tutto il mondo, che rappresentano circa 0,5 milioni di morti all'anno ^9. Il vero numero di infezioni da HCV è sconosciuta, ma recenti stime suggeriscono che 130 – 150 milioni di persone sono cronicamente infette. No vaccine esiste, ma i farmaci antivirali ad azione diretta recentemente approvate drammaticamente aumentare le risposte terapeutiche rispetto alla terapia standard a base di interferone. Tuttavia, a livello mondiale, il trattamento di pazienti sarà probabilmente limitato a causa degli elevatissimi costi delle nuove terapie. Circa la metà di tutti gli individui cronicamente infettati con HCV sviluppano la malattia del fegato grasso (steatosi), una condizione caratterizzata da un accumulo eccessivo di gocce lipidiche in epatociti. Curiosamente, gocce lipidiche sono emerse anche organelli cellulari come essenziali per la replicazione di HCV, putatively servire come siti di assemblaggio virale ^{10, 11.}

Nelle cellule con infezione da HCV, il nucleo proteina virale e NS5A localizzano di goccioline lipidiche in un processo che dipende biosintesi trigliceridi, come inibitori di diacilglicerolo aciltransferasi-1 (DGAT1) compromettere la tratta di goccioline lipidiche e produzione di particelle successiva HCV ¹² </sup^{>, 13, 14, 15.} Inoltre, mutazioni nei lipidi domini goccioline di legame di entrambi core o NS5A sopprimono assemblaggio di HCV ^{16, 17.} Core e NS5A quindi assumere tutte le altre proteine virali, e anche complessi replicazione RNA virale, alle membrane strettamente associati lipidi goccioline ^16. È necessaria un'azione concertata di tutte le proteine virali per la produzione di successo infettiva progenie virale ^{10, 11.} Le proteine ​​strutturali sono parte dei virioni, e le proteine ​​non strutturali promuovono le interazioni proteina-proteina necessari per questo processo. Curiosamente, la bona fide lipidi droplet-binding protein PLIN3 / TIP47 è necessario sia per HCV RNA replicazione e il rilascio di virioni ^{18, 19} <sup>, ^20. Nonostante questi recenti progressi, i dettagli meccanicistici, in particolare di interazione virus-ospite durante le ultime fasi della replicazione di HCV, restano mal definita, e la funzione precisa delle gocce lipidiche è sconosciuta.

Qui, si descrive un metodo per isolare le goccioline lipidiche per la spettrometria di massa quantitativa delle proteine ​​associate. Usando questo metodo, abbiamo trovato profondi cambiamenti nel proteoma lipidi droplet durante l'infezione da HCV e identificato annessina A3 come proteina ospite che co-fraziona con goccioline lipidiche e richiesto per una efficiente HCV maturazione ^21.