Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Lipidtröpfchen sind sehr dynamisch cytoplasmatischen (und nuklear) Zellorganellen , bestehend aus einem Kern aus neutralen Lipiden (Triglyceriden (TG) und Cholesterinester (CE)) durch eine Monoschicht von Phospholipiden mit eingebetteten Proteinen ¹ umschlossen. Alle Zelltypen produzieren Lipidtröpfchen, aber sie unterscheiden sich in Größe, Lipidzusammensetzung und Protein Dekoration. Lipidtröpfchen erfüllen verschiedene Funktionen, unter anderem als Energie und Membranvorläufer Reservoire oder als Proteinablagerungen. Darüber hinaus wird durch die Aufnahme von Lipiden, schützen sie Zellen vor Lipotoxizität, Trenn Lipide als Signalmoleküle, und sind in den Proteinabbau und endoplasmatischen Retikulum (ER) ² Stressantworten beteiligt. Als solche bindet eine Vielzahl von Proteinen an Lipidtröpfchen und regelt ihre Generation, Abbau, handelt, und die Interaktion mit anderen Organellen. Unter ihnen sind die perilipin Familie von bona fide Lipidtröpfchen bindende Proteine (PLIN1-5)f "> 3.

Lipidtropfen Biogenese beginnt wahrscheinlich am IHN, in dem ER-resident Enzyme die Synthese von Neutrallipiden katalysieren , die innerhalb der Membran – Doppelschicht ansammeln, eine Linse aus neutralen Lipiden gebildet wird , ein Verfahren , das in letzter Zeit in Hefe gut ⁴ sichtbar gemacht wurde. Membran Biegen und erhöhter Phosphatidsäure und Diacylglycerin Ebenen werden dann gedacht Proteine in Phospholipid – Biosynthese, wie die gleichzeitige Synthese der Kern neutralen Lipiden und Phospholipiden die Abschirmung für Lipidtröpfchenerzeugung ⁵ erforderlich beteiligt zu gewinnen. Enzyme beherbergen Transmembran- Domänen, die an der ER residieren katalysieren diesen Prozess. Expansion zu großen Lipidtröpfchen erfordert die Aktivität einer anderen Klasse von Lipid-synthetisierende Enzyme, die eine amphipathische Helix Hafen und kann somit aus dem ER zum Lipidtröpfchen reisen. Die Mobilisierung von Lipiden aus Lipidtröpfchen erfolgt durch die lokale Aktivierung des Triglyceride und Diacylglycerin Lipasen adipose Triglycerid – Lipase (ATGL) und hormonsensitive Lipase (HSL) , oder durch verschiedene Wege autophagischen wie Makro- und microlipophagy oder Chaperon-vermittelte autophagy ^6. Lipidtröpfchen der Interaktion mit anderen Zellorganellen, wie Mitochondrien (zur beta-Oxidation und Lipid – Synthese) und ER (für die Lipid – Synthese und Proteintransport), sondern auch mit Lysosomen, Endosomen und den durch intrazelluläre Bakterien ⁷ induzierten Vakuolen. Tatsächlich Bakterien, Viren, Parasiten und sogar Ziellipidtröpfchen für die Replikation und Persistenz, darunter HCV ^8.

HCV – Infektion ist eine der führenden Ursachen für Leberbedingte Morbidität und Mortalität weltweit, ⁹ für etwa 0,5 Millionen Todesfälle pro Jahr ausmacht. Die tatsächliche Zahl der HCV-Infektionen ist nicht bekannt, aber die jüngsten Schätzungen deuten darauf hin, dass 130-150000000 Menschen chronisch infiziert sind. kein vaccine existiert, aber die kürzlich genehmigten direkt wirkenden antiviralen Medikamente therapeutische Reaktionen drastisch erhöhen im Vergleich zur Standard-Interferon-basierten Therapie. Doch weltweit wird wahrscheinlich die Behandlung von Patienten beschränkt werden aufgrund der extrem hohen Kosten der neuen Therapeutika. Etwa die Hälfte aller Menschen chronisch mit HCV entwickeln Fettlebererkrankung (Steatose) infiziert sind, eine durch die übermäßige Ansammlung von Fetttröpfchen in Hepatozyten gekennzeichnet ist. Intriguingly, Lipidtröpfchen entstanden auch als vital Zellorganellen für die HCV – Replikation, mutmaßlich viral als Montagestellen dienenden ^{10, 11.}

In HCV-infizierten Zellen, der virale Proteinkern und NS5A lokalisieren zu Lipidtröpfchen in einem Prozess, der auf Triglycerid – Biosynthese – ^12, als Inhibitoren der Diacylglycerol – Acyltransferase-1 (DGAT1) beeinträchtigt Handel Lipidtröpfchen und nachfolgenden HCV Partikelproduktion hängt </sup^{>, 13, 14, 15.} Darüber hinaus können Mutationen in den Lipidtröpfchen-Bindungsdomänen von entweder Kern oder NS5A unterdrücken HCV – Anordnung ^{16, 17} auf . Kern und NS5A dann alle anderen viralen Proteine rekrutieren, sowie virale RNA – Replikationskomplexe zu Membranen eng mit Lipid assoziierten Tröpfchen ^16. Eine konzertierte Aktion aller viralen Proteine ist für die erfolgreiche Produktion von infektiösen Virusnachkommen ^{10, 11} erforderlich. Die Strukturproteine ​​sind Teil der Virionen und die nicht-strukturellen Proteine ​​fördern, um die Protein-Protein-Wechselwirkungen für dieses Verfahren erforderlich. Erstaunlicherweise wird die bona fide Lipidtröpfchen-bindendes Protein PLIN3 / TIP47 sowohl für HCV – RNA – Replikation erforderlich ist und die Freisetzung von Virionen ^{18, 19} <sup> ^20. Trotz dieser jüngsten Fortschritte, die mechanistischen Details, vor allem von Virus-Wirt-Interaktionen während der späten Stadien der HCV-Replikation, bleiben schlecht definiert, und die genaue Funktion der Lipidtröpfchen ist nicht bekannt.

Hier beschreiben wir ein Verfahren Lipidtröpfchen für die quantitative Massenspektrometrie assoziierter Proteine ​​zu isolieren. Mit dieser Methode fanden wir grundlegende Veränderungen in den Lipidtröpfchen Proteom während eines HCV – Infektion und identifiziert Annexin A3 als Wirt Protein , das mit Lipidtröpfchen zusammen fraktioniert und ist für eine effiziente HCV Reifung ²¹ erforderlich.