Isolation Lipid Droplet pour l'analyse quantitative de spectrométrie de masse

Les gouttelettes lipidiques sont des organelles cellulaires hautement cytoplasmiques (et nucléaires) dynamique composé d'un noyau de lipides neutres (triglycérides (TG) et l' ester de cholestérol (CE)) entourée par une monocouche de phospholipides avec des protéines intégrées ^1. Tous les types de cellules produisent des gouttelettes lipidiques, mais ils varient en taille, la composition des lipides, et la décoration des protéines. Les gouttelettes lipidiques remplissent diverses fonctions, notamment comme réservoirs d'énergie et d'un précurseur de membrane ou en tant que dépôts de protéines. De plus, grâce à l'absorption des lipides, ils protègent les cellules de lipotoxicité, les lipides de libération sous forme de molécules de signalisation, et sont impliqués dans la dégradation des protéines et réticulum endoplasmique (RE) les réponses au stress ^2. En tant que tel, une multitude de protéines se lient à des gouttelettes lipidiques et régissent leur génération, la dégradation, la traite, et l'interaction avec d'autres organelles. Parmi ceux – ci sont la famille périlipine des protéines de liaison des gouttelettes de lipides de bonne foi (PLIN1-5)f "> 3.

Gouttelette lipidique biogenèse commence probablement à l'ER, où les enzymes ER-résident catalysent la synthèse des lipides neutres qui accumulent dans la membrane bicouche, la formation d' une lentille de lipides neutres, un procédé qui a été récemment visualisé bien dans la levure ^4. Membrane de flexion et des taux élevés d'acides phosphatidiques et de diacylglycérol sont alors pensé à attirer des protéines impliquées dans la biosynthèse des phospholipides, comme la synthèse simultanée des lipides neutres de base et les phospholipides de blindage est nécessaire pour la génération de gouttelettes de lipides ^5. Enzymes hébergeant des domaines transmembranaires qui se trouvent à l'ER catalysent ce processus. Extension de grosses gouttelettes de lipides nécessite l'activité d'une autre classe d'enzymes de synthèse de lipides qui abritent une hélice amphipathique et peut ainsi se déplacer à partir de l'ER à des gouttelettes lipidiques. La mobilisation des lipides de gouttelettes lipidiques se produit par l'activation locale du triglycéridee lipase et diacylglycérol triglycéride lipases adipeux (ATGL) et de la lipase sensible aux hormones (HSL) ou par différentes voies de autophagiques, tels que autophagie macro- et microlipophagy ou chaperon à médiation ^6. Les gouttelettes lipidiques interagissent avec d' autres organelles cellulaires tels que mitochondries (pour la bêta-oxydation et la synthèse des lipides) et ER (pour la synthèse des lipides et le trafic de protéine), mais aussi avec les lysosomes, les endosomes et les vacuoles induites par des bactéries intracellulaires ^7. En effet les bactéries, les virus, les parasites et même cible gouttelettes lipidiques pour la réplication et la persistance, parmi eux le VHC ^8.

L' infection par le VHC est l' une des principales causes de la morbidité liée au foie et mortalité dans le monde, ce qui représente environ 0,5 million de décès par an ^9. Le nombre réel d'infections par le VHC est inconnu, mais les estimations récentes suggèrent que 130 – 150 millions de personnes sont chroniquement infectées. pas VACCINe existe, mais l'augmentation a récemment approuvé Antiviraux-à action directe de façon spectaculaire les réponses thérapeutiques par rapport à la thérapie à base d'interféron standard. Cependant, dans le monde entier, le traitement des patients sera probablement limitée en raison des coûts extrêmement élevés des nouveaux traitements. Environ la moitié des personnes chroniquement infectées par le VHC développent une maladie du foie gras (stéatose), une condition caractérisée par l'accumulation excessive de gouttelettes lipidiques dans les hépatocytes. Intrigant, des gouttelettes lipidiques ont également émergé comme organites cellulaires vitaux pour la réplication du VHC, au service putative comme sites d'assemblage viraux ^{10, 11.}

Dans les cellules infectées par le VHC, le noyau de la protéine virale et NS5A localisent à des gouttelettes de lipides dans un processus qui dépend de la biosynthèse des triglycérides, en tant qu'inhibiteurs de la diacylglycérol acyltransférase 1 (DGAT1) compromettre le trafic de gouttelettes lipidiques et la production de particules de VHC subséquente ¹² </sup^{>, 13, 14, 15.} En outre, des mutations dans les domaines de gouttelettes lipidiques de liaison de l' une ou noyau NS5A du VHC suppriment l' assemblage ^{16, 17.} Core NS5A recrutent alors toutes les autres protéines virales, ainsi que des complexes de réplication d'ARN viral, des membranes étroitement associées à des gouttelettes lipidiques ^16. Une action concertée de toutes les protéines virales est nécessaire pour la production réussie de la descendance virale infectieuse ^{10, 11.} Les protéines structurelles font partie des virions, et les protéines non structurales favorisent les interactions protéine-protéine nécessaire à ce processus. Curieusement, la protéine de liaison aux lipides gouttelettes de bonne foi PLIN3 / TIP47 est nécessaire à la fois pour la replication de l' ARN du VHC et la libération des virions ^{18, 19} <sup>, ^20. En dépit de ces progrès récents, les détails mécanistiques, en particulier des interactions virus-hôte au cours des dernières étapes de la réplication du VHC, restent mal définis, et la fonction précise des gouttelettes lipidiques est inconnue.

Nous décrivons ici une méthode pour isoler des gouttelettes lipidiques pour la spectrométrie de masse quantitative des protéines associées. En utilisant cette méthode, nous avons trouvé des changements profonds dans le protéome des gouttelettes de lipides lors de l' infection par le VHC et l' annexine A3 identifié comme une protéine hôte qui co-fractionne avec des gouttelettes lipidiques et est nécessaire pour la maturation du VHC efficace ^21.