荧光为基础的神经氨酸酶抑制测定流感病毒的易感性评估抗病毒药的神经氨酸酶抑制剂类

1.确定荧光产物4-MU的一个荧光的线性范围通过在5mL无水乙醇中溶解11.3毫克4-MU的制备10毫升6.4毫4-MU原液。加入5毫升0.9％的NaCl（W / V）到原液，使10毫升。通过在1×毫升9测定缓冲液（33.3毫2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）和4mM CaCl 2的，pH 6.5）中稀释1毫升6.4毫4-MU的制备640μM的工作溶液。 注意：通过将13克MES和8 2至992的1M的CaCl毫升毫升蒸馏水准备2X测定缓冲液中。调整使用NaOH的10 M中的pH值至6.5。过滤使用孔径为0.2μm的无菌醋酸纤维素过滤器的缓冲区。警告！氢氧化钠是腐蚀性，并可能导致化学灼伤皮肤和眼睛。确保全套个人防护装备佩戴。 制备一系列4-MU浓度（ 即，5μM，10μM，20μM，40μM，80μM，160＆＃的5mL的181; M和320μM）通过使用1×测定缓冲液中640μM4-MU的2倍系列稀释。 分配4-MU（ 即 ，5μM，10μM，20μM，40μM，80μM，160μM，320μM和640μM）（每个稀释两个孔）成清晰，96的各系列稀释的50μL的孔平底板和50μL1×测定缓冲液中的进入剩余孔（其作为空白以测量背景信号）。 注意：在该反应体积中的最终浓度4-MU（50μL4-MU + 50μL300μMMUNANA）是2.5μM，5μM，10μM，20μM，40μM，80μM，160μM和320μM 。 通过在20毫升的蒸馏水重构25毫克MUNANA的制备的2.5mM MUNANA储备溶液。混合0.72毫升2.5姆·芒南的用1x毫升5.28测定缓冲液以获得300μMMUNANA工作溶液（足够的体积为一个板）。覆盖含有300μMMUNANA干活的管用铝箔克溶液，并保持在冰上，除非立即使用。丢弃任何剩余的材料。 注：2.5mM的MUNANA储备溶液可以储存在-20℃下1个月，并且必须一个冷冻/解冻循环内使用。 4-MU和MUNANA解决方案是光敏感的，必须从长时间曝光的保护。 添加300μMMUNANA50μL的每个孔中，轻轻拍打以混合，并在37℃下温育30分钟。盖上板密封，以防止水分蒸发的板块。 注意：此步骤是考虑到在NA抑制测定背景荧光。 通过混合11毫升无水乙醇中以2.225毫升0.824 1M的NaOH的（足够的体积为一个板）准备终止溶液。 加入100μL终止液至每个孔以停止反应，并轻轻拍打混合。 读取使用具有355纳米的激发波长设定和460nm的发射波长设置荧光计板中，如PEr是制造商的说明。 计算使用来自不含有4-MU的所有孔的荧光信号的平均背景信号。减去各含有4-MU的孔的该平均背景信号并计算平均信号（RFU）对于每个4-MU浓度。绘制RFU的标准曲线针对4-MU浓度（μM），如在图1a中示出;曲线的特写线性截面示于图1b。 可视化RFU的针对4-MU浓度（μM），以确定线性范围和最佳的目标信号的曲线图;线性范围是，其中按比例的荧光信号增加至4-MU上的情节的浓度的增加，而最佳的目标信号是在线性范围内的任意的4-MU浓度。 注：线性范围和最佳的目标信号是荧光计特定的。例如，在墨尔本WHOCCRRI荧光计具有2的线性范围0.5-40μM4-MU和30〜μM4-MU，其对应于〜1500 RFU的最佳目标信号。 2.确定病毒的NA活性注：流感病毒培养至在将Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞或胚鸡蛋8足够滴度。 分配每未稀释的培养流感病毒的阱120μL到塔1和1x测定缓冲液的60微升含0.1％NP-40到96孔，U型底的板的其余11列。 串联横跨板进行的病毒两倍稀释（ 即，从第1列转移60微升至第2列，等等，直至第11列），使用多道移液器，离开塔12仅含有1×测定缓冲液空白。 从各孔中（稀释病毒和空白）的转移50μL的成清晰，96孔，平底板上。 注：这是没有必要到c焊割移液管尖端，如果材料被从塔12通过传递到第1列。 添加300μMMUNANA 50μL（按照步骤1.4中制备）每孔并轻轻拍打板以混合。孵育在37℃下将板1个小时。盖上板密封，以防止水分蒸发的板块。 添加100μL的终止溶液（按照步骤1.6中制备）每孔中以终止反应，并轻轻拍打板以混合。 阅读使用荧光板。 使用的355纳米的激发波长设定和460nm的发射波长设置。 确定基于在列12中的荧光读数平均背景信号和从各孔中减去平均背景信号。绘制RFU针对病毒稀释度的曲线图。 注意：在WHOCCRRI墨尔本100μMMUNANA背景值典型地50和120之间的RFU，但是这些将根据荧光计贝不同纳克使用。 查看针对病毒稀释液RFU的曲线，以确定每个病毒（ 图2）的曲线的线性部分的中点。使用最佳的目标信号（在步骤1中确定的）作为基准点。 注意：这应与在第1确定的荧光计的4-MU线性范围对应，并且将提供在部分3中使用的病毒的适当的浓度。 3.评估病毒易感性的NA抑制剂使用NA抑制测定 在300μM的浓度制备NA抑制剂的主股。 由5.0毫克扎那米韦溶解于2×毫升50分析缓冲液（66.6毫MES和8毫米氯化钙2，pH 6.5）中制备300μM的扎那米韦（分子量，MW =332.32克/摩尔）。 通过在50ml 2×试验缓冲液的5.8毫克溶解;制备300μM奥塞米韦羧酸盐（MW =386.44克/摩尔D-酒石酸盐）。 准备300μM帕拉米韦三水合物（MW =382.45克/摩尔）通过在50ml 2×试验缓冲液的5.7毫克溶解。 通过在50ml 2×试验缓冲液的5.2毫克溶解制备300μM拉尼米韦（MW =346.34克/摩尔）。 注意：NA抑制剂主股可以储存在-20℃下12个月。检查NA抑制剂的MW以确保正确的重量和体积都在复原中使用。的奥塞米韦羧酸盐是前药的磷酸奥司他韦的活性化合物。因此，只有奥塞米韦羧酸盐应在NA抑制试验中使用。 从主股票，准备在0.03纳米，0.3纳米，3纳米，30纳米，300纳米，3000纳米的浓度工作在50mL离心管中的NA抑制剂的10倍系列稀释的股，和30000纳米的2X测定缓冲液（66.6毫MES和8毫米氯化钙2，pH 6.5）中;这是一个跨多个试验使用。 注意：在该反应volum的最终浓度NA抑制剂E（病毒稀释+ 50 NA的μL抑制剂+ 50 300μMMUNANA的μL的50μL）是0.01纳米，0.1纳米，1纳米，10纳米，100nm时，1000纳米，和10,000纳米，分别。的最终浓度不包括100微升的终止溶液。存储在2-8℃NA所有抑制剂稀释液。到期日期是相同主股。 制备在1×测定缓冲液中的病毒稀释液含有在96深孔块0.1％NP-40表面活性剂。使用基于从部分2得到的NA活性测定结果病​​毒稀释使用每病毒2毫升的总体积，以测试4 NA抑制剂。 注：准备每病毒两个孔（每孔1毫升）在96深孔块。病毒稀释液进行病毒1，2，和3中的实例示于表1中 。 分配NA抑制剂（按照步骤3.2中制备）的所需要的体积为8深井水库。从那里，在稀释范围分配50 NA抑制剂μL从0纳米（2X测定B仅uffer）〜30000nm的行A至H中一个明确的，96孔，平底板上。 注：板布局在图3中示出。 每孔加入50微升的稀释的测试病毒的列1-11和每1×测定缓冲液中的孔50μL只塔12轻轻敲击板以混合，并在室温下孵育45分钟。盖上板密封，以防止水分蒸发的板块。 添加300μMMUNANA 50μL（按照步骤1.4中制备）每孔并轻轻拍打板以混合。孵育在37℃下将板1个小时。盖上板密封，以防止水分蒸发的板块。 添加100μL的终止溶液（按照步骤1.6中制备）到每个孔中，并轻轻拍打板以混合。 阅读使用荧光板。 使用的355纳米的激发波长和460nm的发射波长，如先前所描述。 4.计算IC50值注：JASPR V1.2是曲线拟合软件，使IC 50值的计算。该软件是由流感司在疾病预防控制中心，美国亚特兰大开发的。该软件利用等式：V = V 最大 ×（1 – （[I] /（K I + [I]））），其中V max是代谢的最大速率，[I]是抑制剂浓度，V是该响应被禁止，和K i是抑制曲线的IC 50。 复制并粘贴由荧光计输出到一个12塔板的格式（96孔）电子表格中的原始数据，从单元格A1。 注：原从每个后续板的数据必须通过一个空行错开。如果每个病毒已被针对4种NA抑制剂测试，粘贴一组四个的原始数据（与每个板之间的空行）。 打开安装软件和CLICK的“实验”选项卡上。选择“替代2药物氟11个样品。” 单击“选项”选项卡，并勾选“生成图”。 再次点击“选项”，然后单击“新建项”选项卡上。保存“inhibition_key” .csv文件在同一文件夹中的原始数据表格文件。 在inhibition_key文件，列出以下ID的所有样品名称。每个样品名称必须是唯一的。 如果四个NA抑制剂进行了测试，插入空格下面奥塞米韦两个附加行，键入“帕拉米韦”和“拉尼米韦”。保存到inhibition_key文件所做的更改。 返回到“jaspr 1.2抑制曲线拟合”窗口，选择原始数据文件作为“实验文件”和inhibition_key的“密钥文件”。运行分析。保存为.csv和.pdf格式的结果。 注：该软件会自动绘制抑制曲线（RFU agaiNST NA抑制剂浓度），如示于图4。该程序还计算针对个体NA抑制剂（ 图4）的每种病毒的IC 50值。此外，JASPR呈现IC 50值和信号对背景（S / B）比率在电子表格的格式。背景值可以从实验室取决于所使用的荧光计的不同而不同实验室。在墨尔本WHOCCRRI，背景为100μMMUNANA范围内的值从50至120 RFU。一个可靠的IC 50值，的一个≥10S / B比是优选的，虽然小于10的比率是仍可接受的，特别是对于具有非常低的NA活性的突变病毒。 检查IC 50值和由软件产生的曲线的形状。所有的数据点应落在或靠近曲线;如果他们不这样做，重复NA抑制试验。 注：对于病毒显示异常高的IC 50值，试验应重复ED确认结果。