bir<em> In vitro</emTüberküloz Lezyonlarında İlaç Penetrasyonunu Öngören Caseum Bağlanma Testi
Summary
Burada pulmoner tüberküloz lezyonlarından ve boşluklardan alınan kaseum ile ilacın bağlanmasını ölçmek için hızlı bir denge diyaliz (RED) yöntemi anlatılmaktadır. Protokol, aynı zamanda, kaseum için etkili bir vekil olan köpüklü makrofaj kaynaklı bir matriste de kullanılır.
Abstract
Tüberküloz hastalığının ortadan kaldırılması, kompleks pulmoner lezyonların çok katmanına nüfuz edebilen ilaç rejimleri gerektirir. Çukurların ve lezyonların kazeöz damarlarındaki ilaç dağılımı, özellikle persistan olarak da adlandırılan uyuşturucuya dirençli bakterilerin alt popülasyonlarını barındırdığı için çok önemlidir. Tüberküloz lezyonlarında ilaç penetrasyonunun ölçülmesine ilişkin mevcut metotlar, biyoanalitik veya görüntüleme teknikleriyle birleştirilen yüksek maliyetli ve zaman alan in vivo farmakokinetik çalışmaları içerir. Kozmetik makromoleküllere bağlanan ilacın in vitro ölçümü, bu tür teknikler için bir alternatif olarak önerildi çünkü bu bağlanma, ilaç moleküllerinin kaseum yoluyla pasif difüzyonunu engelledi. Hızlı denge diyalizi plazma proteini ve doku bağlama çalışmalarında hızlı ve güvenilir bir sistemdir. Bu protokolde, kazanın homojenatlarına ilaç bağlanmasını ölçmek için hızlı denge diyaliz (RED) cihazı kullandık.Tüberküloz ile enfekte tavşanların lezyonlarından ve boşluklarından türetilmiştir. Protokol ayrıca, kaseum yerine kullanılacak lipid yüklü THP-1 makrofajlarından bir vekil matrisi nasıl oluşturulacağını açıklar. Bu kaseum / vekil bağlanma testi, tüberküloz ilaç keşfi için önemli bir araçtır ve lezyonlarda veya apselerde diğer hastalıkların yol açtığı ilaç dağılımının araştırılmasına yardımcı olmak için uyarlanabilir.
Introduction
akciğer tüberkülozu hastalığının tedavisi lezyonlar farklı içine ilaç etkin dağıtım gerektirir. Nekrotik lezyonlar ve boşluklar ilaç toleranslı veya 'kalıcı' bakteri alt-popülasyonunu liman peynir merkez içerir. 1, 2 kaviter hastalık alt kür oranları ve kötü prognoz ile ilişkilidir. 3, 4 önceki çalışmalar caseum nüfuz kabiliyeti önemli ölçüde bir ilaç sınıfı diğerine değişir, nicel ve görüntüleme teknikleri kullanılarak, göstermiştir. 5, 6 Ancak bu yöntemler, yavaş ve zahmetlidir hayvan enfeskiyon modellerinden kullanılmasını gerektirir. Ex vivo olarak caseum bağlanma ilaç ölçen bir in vitro deney tasarlanmıştır. Bu ters nedenle, peynir granülomada ilaç nüfuzunun ile ilişkili ve bulunmuştur bağlanma, birTahmin edici bir araç olarak kullanılmıştır. 7
Dengeleme diyalizi, plazma protein bağlama çalışmalarına altın standart yaklaşım olarak görülür. Hızlı denge diyalizi (RED) cihazı, bu tür testleri gerçekleştirmek için hızlı, kullanımı kolay ve güvenilir bir sistem sağlar. 8 Cihaz iki bileşenden oluşur: yarı geçirgen zarın dikey bir silindiri ile ayrılmış 2 hazneden oluşan tek kullanımlık, tek kullanımlık uçlar; Ve aynı anda 48 ek parça tutabilen tekrar kullanılabilir taban plakaları. Diyaliz membranı, ilaç-makromolekül bağlama çalışmaları için ideal olan 8 kDa moleküler ağırlıklı bir kesime (MWCO) sahiptir. Membran kompartmanının yüksek yüzey alanı / hacim oranı, hızlı diyaliz ve dengeleme sağlar. Hem ekler hem de taban plakası, asgari spesifik olmayan bağlanma için onaylanmıştır. RED cihazının biyoanalitik tekniklerle kombinasyonu, ilaçların bağlanmamış fraksiyonlarının kesin tahminlerini plasma. 8 , 9
Başlangıçta plazma protein bağlanmasını ölçmek için tasarlanmış olmasına rağmen, RED cihazı homojenatları kullanarak çeşitli doku bağlama çalışmalarında kullanılmıştır. 10 , 11 Bu protokolde, tüberkülozla enfekte tavşanların nekrotik lezyonlarından ve boşluklarından eksize edilen nekrotik çöpler, kaseum ile ilacın bağlanmasını ölçüyoruz. Caseus materyalinin asellüler ve non-vascular özelliği, tahlil ile uyumlu homojen bir süspansiyona homojenleştirilmesini kolaylaştırır.
Kaseum üretmek için sıkıcı ve zor gelmesi nedeniyle, protokol de köpüklü makrofajlardan hazırlanan bir vekil matris ile kullanım için onaylanmıştır. THP-1 monosit türevi makrofajlar, onlara 'köpüklü' görünüm veren çoklu lipid cisimcikleri biriktirmek için oleik asit ile indüklenir. Bu lipit yüklü hücreler hasat edilir veBiz caseum için bir ikame olarak kullanmak, bir matris üretmek üzere işlenir. Bu çalışma, bu taşıyıcı matris etkin bir granülomlar ve boşlukların peynir çekirdek ilacın nüfuz etmesine engel in vivo işlemi taklit caseum bağlanma ile iyi bir korelasyon ile bağlanan ilaç göstermiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tüberkülozla enfekte hastalarda pulmoner nekrotik lezyonlar ve boşluklar, ilaç tedavisine dirençli bakteri alt popülasyonlarını içerir. Bu yapıların kazeöz çekirdeği, özellikle, bu persisörleri ekstraselüler bir ortamda barındırmaktan sorumludur. Anti-bakteriyel maddelerin bu uzak yerlere olumlu dağılımının tüberküloz ilaç etkinliğinin önemli bir belirleyicisi olduğuna inanılmaktadır. Bu protokolün onaylanmasından önce, konstitüsyonel lezyonlarda ilaç keşfi bileşiklerinin dağılı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz sırasıyla, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid ve tedizolid Bedaquiline sağlamak için Johnson & Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Kaburga-X ve Trius Therapeutics teşekkür etmek istiyorum. Brendan Prideaux Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin Emma Rey-Jurado Nancy Ruel, Leyan Li ve Danielle Weiner MALDI analizi, biyoanalitik yöntemler, caseum vekil hazırlanması, kimyasal sentez ve tavşan caseum izolasyonu ile destek sağlamıştır. Bu çalışma V. Dartois NIH Paylaşılan Enstrümantasyon Grant S10OD018072 yanı sıra Mükemmellik Bir Merkezi için Bill ve Melinda Gates Vakfı ve Wellcome Trust ortak finansmanı için Bill ve Melinda Gates Vakfı tarafından finanse ödül # OPP1044966 ve OPP1024050 ile yürütülmüştür P. VVyatt'a Gelişen Dünya Hastalıklar Kurşun Optimizasyonu için.
Materials
| New Zealand White Rabbits | Covance | – | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
| RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hyclone L-glutamine, 200mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Cellstar TC dish, 145x20mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| Phorbol 12-myristate13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
| Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
| Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
| Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| PBS, pH7.4, 10 X 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | |
| Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
| Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
| 484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
| INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
| Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
| Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
| Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |
References
- Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
- Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).
- Aber, V. R., Nunn, A. J. Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy. Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).
- Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells. Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Sarathy, J. P., et al. Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions. ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).
- Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding. J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).
- Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma. J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).
- Liu, X., et al. Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid. Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).
- Able, S. L., et al. Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat. Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).
- Via, L. E., et al. Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates. Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).
- Kalvass, J. C., Maurer, T. S. Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery. Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).
- Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis. J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).
- Lenaerts, A. J., et al. Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910. Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
