Un<em> In Vitro</em> Caseosa Ensayo de unión que permite predecir la penetración de fármacos en la tuberculosis lesiones

El tratamiento de la tuberculosis pulmonar requiere una distribución eficaz de fármacos en diferentes tipos de lesiones. Las lesiones necróticas y las cavidades contienen centros caseosos que albergan subpoblaciones de bacterias tolerantes a los fármacos o "persistentes". ^{1 , 2} La enfermedad cavitaria se asocia con tasas de curación inferiores y mal pronóstico. ^{3 , 4} Estudios previos han demostrado, usando técnicas cuantitativas y de imágenes, que la capacidad de penetrar el caseo varía significativamente de una clase de fármaco a otra. ^{5 , 6} Estos métodos, sin embargo, requieren el uso de modelos de infección animal que son lentos y tediosos. Se diseñó un ensayo in vitro que mide la unión del fármaco al caseo ex vivo . Se encontró que esta unión se correlacionaba inversamente con la penetración del fármaco en granulomas caseosos y, por lo tanto, esUtilizado como herramienta predictiva. ⁷

La diálisis de equilibrio se considera como el método estándar de oro para los estudios de unión a proteínas plasmáticas. El dispositivo de diálisis de equilibrio rápido (RED) proporciona un sistema rápido, fácil de usar y fiable para realizar tales ensayos. ⁸ El dispositivo se compone de dos componentes: insertos de un solo uso y desechables compuestos de 2 cámaras separadas por un cilindro vertical de membrana semipermeable; Y placas de base reutilizables que pueden contener hasta 48 insertos a la vez. La membrana de diálisis tiene un corte de peso molecular de 8 kDa (MWCO) que es ideal para estudios de unión de fármacos-macromoléculas. La alta relación superficie / volumen del compartimento de membrana permite una diálisis rápida y equilibrio. Tanto los insertos como la placa de base han sido validados para una unión no específica específica. La combinación del dispositivo RED con técnicas bioanalíticas proporciona estimaciones precisas de las fracciones no unidas de fármacos en pLasma ^{8 , 9}

Aunque originalmente se diseñó para medir la unión a proteínas plasmáticas, el dispositivo RED se ha utilizado en varios estudios de unión de tejidos utilizando homogenados. ^{10 , 11} En este protocolo, medimos la unión del fármaco al caseo, los residuos necróticos escindidos de las lesiones necróticas y cavidades de los conejos infectados con tuberculosis. La naturaleza acelular y no vascular del material caseoso hace que sea fácil de homogeneizar en una suspensión homogénea que sea compatible con el ensayo.

Dado que el caseum es tedioso para producir y difícil de conseguir, el protocolo también ha sido validado para su uso con una matriz sustituta que se prepara a partir de macrófagos espumosos. Los macrófagos derivados de monocitos THP-1 son inducidos con ácido oleico para acumular múltiples cuerpos lipídicos que les dan su aspecto "espumoso". Estas células cargadas de lípidos se cosechan yprocesada para producir una matriz que usamos como un sustituto para caseosa. Este estudio ha demostrado la unión a esta matriz sustituta se correlaciona bien con la unión a caseosa, imitando eficazmente el proceso in vivo que impide la penetración del fármaco en el núcleo caseosa de granulomas y cavidades que de drogas.