<em> In Vitro</em> Анализ связи с казумом, который прогнозирует проникновение наркотиков в очаги туберкулеза
Summary
Здесь мы описываем метод быстрого равновесного диализа (RED) для измерения связывания лекарственного средства с казумом от поражений и полостей легочного туберкулеза. Протокол также используется с матрицей, полученной из пенистого макрофага, которая является эффективным суррогатом казума.
Abstract
Для искоренения туберкулеза необходимы схемы лекарств, которые могут проникать во множество слоев сложных легочных очагов. Распределение лекарств в казеозных ядрах полостей и поражений особенно важно, поскольку они содержат субпопуляции лекарственно-толерантных бактерий, которые также часто называют персистерами. Существующие методы измерения проникновения лекарств в очаги туберкулеза требуют дорогостоящих и длительных исследований фармакокинетики in vivo в сочетании с методами биоанализа или визуализации. В качестве альтернативы таким методам было предложено измерение связывания лекарства с макромолекулами кадьюма in vitro, поскольку это связывание препятствует пассивной диффузии молекул лекарственного средства через казум. Быстрорадикальный диализ – это быстрая и надежная система для проведения исследований связывания с белками плазмы и тканей. В этом протоколе мы использовали прибор с быстрым равновесным диализом (RED) для измерения связывания лекарственного средства с гомогенатами казума, который представляет собой эксцизиюВызванных поражениями и полостями инфицированных туберкулезом кроликов. Протокол также описывает, как создать суррогатную матрицу из макрофагов THP-1, нагруженных липидами, для использования вместо казума. Этот анализ казума / суррогатного связывания является важным инструментом при обнаружении лекарств от туберкулеза и может быть адаптирован для изучения распределения лекарственных средств при поражениях или абсцессах, вызванных другими заболеваниями.
Introduction
Лечение туберкулеза легких требует эффективного распределения препаратов в различных типах поражений. Некротические поражения и полости содержат казеозные центры, которые содержат субпопуляции лекарственно-устойчивых или «стойких» бактерий. 1 , 2 Кавитационная болезнь связана с низкими показателями излечения и плохим прогнозом. 3 , 4 Предыдущие исследования показали, используя количественные методы и методы визуализации, что способность проникать в казуум значительно варьирует от одного класса наркотиков к другому. 5 , 6 Эти методы, однако, требуют использования моделей заражения животных, которые являются медленными и утомительными. Был разработан тест in vitro, который измеряет связывание лекарственного средства с ex vivo caseum. Было установлено, что это связывание обратно коррелирует с проникновением лекарств в казеозные гранулемы и, следовательно, являетсяиспользуется в качестве инструмента прогнозирования. 7
Равновесие диализ рассматриваются как золотой стандарт подхода к белкам плазмы исследованию связывания. Быстрый равновесный диализ (RED) устройство обеспечивает быструю, легкую в использовании и надежную систему для выполнения таких анализов. 8 Устройство состоит из двух компонентов: одноразовое использование, одноразовых вкладышей , состоящих из 2 -х камер , разделенных вертикального цилиндра полупроницаемой мембраны; и повторно используемые базовые пластины, которые могут содержать до 48 вставок в то время. Диализ мембрана имеет 8 кД молекулярной массы срез (MWCO), что идеально подходит для исследования связывания с наркотиками макромолекулы. Высокое отношение площади поверхности к объему мембранного отсека позволяет быстро диализ и уравновешивание. Обе вставка и базовая пластина были проверены для минимально неспецифического связывания. Сочетание RED устройства с биоаналитическими методами обеспечивает точные оценки несвязанных фракций лекарственных средств в рЛАЗМА. 8, 9
Хотя первоначально предназначено для измерения связывания с белками плазмы, КРАСНОЕ устройство используется в нескольких тканях исследования связывания с использованием гомогенат. 10, 11 В этом протоколе, мы оцениваем препарат связывания с caseum, некротическим мусор вырезал из некротических поражений и полостей туберкулеза-инфицированных кроликов. Бесклеточное и не сосудистое характер казеозного материала позволяет легко гомогенизировать в гомогенную суспензию, который совместит с анализом.
Учитывая, что caseum утомительно производить и трудно найти, протокол также был утвержден для использования с суррогатной матрицей, получают из пенистых макрофагов. ТНР-1 моноцитов макрофаги индуцируются с олеиновой кислотой, чтобы накопить несколько липидных тел, которые дают им их «пенистый» внешний вид. Эти липидные загруженные клетки собирают иОбрабатывается для получения матрицы, которую мы используем в качестве суррогата caseum. Это исследование показало, что связывание лекарственного средства с этой суррогатной матрицей хорошо коррелирует со связыванием с казумом, эффективно имитируя процесс in vivo , который препятствует проникновению наркотиков в казеозную сердцевину гранулем и полостей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Легочные некротические поражения и полости у больных туберкулезом содержат субпопуляции бактерий, которые не поддаются лечению. Казеозные ядра этих структур особенно ответственны за укрывательство этих персистеров во внеклеточной среде. Благоприятное распределение антибактериаль…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Johnson & Johnson, Альянс TB, Astra Zeneca, Rib-X и Триус Therapeutics для обеспечения bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid и тедизолид соответственно. Брендан Прайдо, Мэтью Циммерман, Стивен Джузвин, Эмма Рей-Хурадо, Нэнси Руел, Льян Ли и Даниэла Вайнер оказывал поддержку с анализом MALDI, биоаналитических методов, подготовки caseum суррогата, химический синтез и выделение кролика caseum. Эта работа была проведена при финансовой поддержке Фонда Билла и Мелинда Гейтс, удостоенный # OPP1044966 и OPP1024050 к V Дартуа, NIH Shared Instrumentation Грант S10OD018072, а также совместного финансирования со стороны Фонда Билла и Мелинды Гейтс и Wellcome Trust для центра передового опыта для свинца оптимизации для болезней развивающегося мира P Уайат.
Materials
| New Zealand White Rabbits | Covance | – | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
| RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hyclone L-glutamine, 200mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Cellstar TC dish, 145x20mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| Phorbol 12-myristate13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
| Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
| Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
| Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| PBS, pH7.4, 10 X 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | |
| Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
| Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
| 484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
| INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
| Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
| Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
| Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |
References
- Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
- Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).
- Aber, V. R., Nunn, A. J. Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy. Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).
- Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells. Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Sarathy, J. P., et al. Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions. ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).
- Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding. J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).
- Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma. J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).
- Liu, X., et al. Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid. Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).
- Able, S. L., et al. Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat. Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).
- Via, L. E., et al. Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates. Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).
- Kalvass, J. C., Maurer, T. S. Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery. Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).
- Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis. J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).
- Lenaerts, A. J., et al. Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910. Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
