Een<em> In Vitro</em> Caseum Binding Assay die de penetratie van drugs in tuberculose-lesingen voorspelt
Summary
Hier beschrijven we een werkwijze snel evenwicht dialyse (RED) drug binding aan ca- seum longtuberculose laesies en holtes meten. Het protocol wordt ook gebruikt met een schuimige-macrofaag afgeleide matrix met een effectieve surrogaat voor ca- seum.
Abstract
De uitroeiing van de ziekte van tuberculose vereist geneesmiddelenregimes die de veelvoudige lagen van complexe pulmonale letsels kunnen binnendringen. Drugsverdeling in de caseous kernen van holtes en laesies is vooral cruciaal omdat ze subpopulaties van drugstolerante bacteriën bezitten, ook vaak aangeduid als persisters. Bestaande methoden voor de meting van drugspenetratie bij tuberculose-laesies zijn kostbare en tijdrovende in vivo farmacokinetische studies gekoppeld aan bioanalytische of imaging technieken. De in vitro meting van drug binding aan caseum macromoleculen werd voorgesteld als een alternatief voor dergelijke technieken, aangezien deze binding de passieve diffusie van geneesmiddelmoleculen door caseum verhindert. Snelle evenwichtsdialyse is een snel en betrouwbaar systeem voor het uitvoeren van plasma-eiwit- en weefselbindingstudies. In dit protocol gebruikten we een snelle equilibrium dialysis (RED) -apparaat om bindend te zijn aan homogenaten van caseum dat excis isUit de laesies en holtes van tuberculose-geïnfecteerde konijnen. Het protocol beschrijft ook hoe u een surrogaatmatrix wilt genereren uit lipide geladen THP-1 macrofagen om in plaats van caseum te gebruiken. Deze caseum / surrogaatbindingstest is een belangrijk hulpmiddel bij het ontdekken van tuberculose-geneesmiddelen en kan aangepast worden om de verspreiding van geneesmiddelen bij letsels of abscesses die door andere aandoeningen worden veroorzaakt, te helpen bestuderen.
Introduction
De behandeling van pulmonale tuberculose ziekte vereist effectieve verdeling van geneesmiddelen in verschillende soorten laesies. Necrotische laesies en holtes bevatten caseous centra die subpopulaties van drugstolerante of 'aanhoudende' bacteriën bezitten. 1 , 2 De cavitusziekte is geassocieerd met minderwaardige geneeskracht en een slechte prognose. 3 , 4 Vorige studies hebben aangetoond dat met behulp van kwantitatieve en beeldvormende technieken de mogelijkheid om caseum te penetreren significant verschilt van de ene geneesmiddelklasse naar de andere. 5 , 6 Deze methoden vereisen echter het gebruik van dierlijke infectiemodellen die traag en vervelend zijn. Een in vitro test die geneesmiddelen bindt aan ex vivo caseum is ontworpen. Deze binding bleek omgekeerd te correleeren met drugpenetratie in caseous granulomas en is derhalveGebruikt als voorspellend hulpmiddel. 7
Evenwichtsdialyse wordt beschouwd als de gouden standaardbenadering voor plasma-eiwitbindende studies. De snelle equilibrium dialysis (RED) -inrichting biedt een snel, makkelijk te gebruiken en betrouwbaar systeem voor het uitvoeren van dergelijke analyses. 8 Het apparaat bestaat uit twee componenten: eenmalig gebruik, wegwerpinzetten bestaande uit 2 kamers gescheiden door een verticale cilinder van semi-doorlatend membraan; En herbruikbare basisplaten die maximaal 48 inzetstukken tegelijk kunnen bevatten. Het dialysemembraan heeft een afscheiding van 8 kDa molecuulgewicht (MWCO) dat ideaal is voor drug-macromolecule bindingsstudies. De hoge oppervlakte-volume verhouding van het membraancompartiment zorgt voor snelle dialyse en evenwicht. Zowel de inzetstukken als de basisplaat zijn gevalideerd voor minimale niet-specifieke binding. De combinatie van het RED-apparaat met bioanalytische technieken zorgt voor nauwkeurige schattingen van de ongebonden fracties van geneesmiddelen in pLasma. 8 , 9
Hoewel oorspronkelijk ontworpen om plasma-eiwitbinding te meten, is het RED-apparaat gebruikt in verschillende weefselbindende studies waarbij gebruik wordt gemaakt van homogenaten. 10 , 11 In dit protocol, we meten bindmiddel aan caseum, de necrotische vuilnis uitgesneden uit de necrotische laesies en holtes van tuberculose-geïnfecteerde konijnen. De acellulaire en non-vasculaire aard van caseous materiaal maakt het gemakkelijk homogeniseren in een homogene suspensie die compatibel is met de test.
Aangezien dat caseum vervelend is om te produceren en moeilijk te verkrijgen is, is het protocol ook gevalideerd voor gebruik met een surrogaatmatrix die uit schuimige macrofagen wordt bereid. THP-1 monocyt-afgeleide macrofagen worden geïnduceerd met oliezuur om meerdere lipide lichamen op te halen die hen hun 'schuimige' uitstraling geven. Deze lipide geladen cellen worden geoogst enVerwerkt om een matrix te produceren die we als surrogaat gebruiken voor caseum. Deze studie heeft aangetoond dat drug binding aan deze surrogaatmatrix goed corrigeert met binding aan caseum, effectief nabootsen van het in vivo proces dat de penetratie van drugs in de caseous kern van granulomen en holtes belemmert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pulmonale necrotische letsels en holtes bij tuberculose-geïnfecteerde patiënten bevatten subpopulaties van bacteriën die onaantrekkelijk zijn voor de behandeling van geneesmiddelen. De caseous kernen van deze structuren zijn in het bijzonder verantwoordelijk voor het inhuren van deze persisten in een extracellulaire omgeving. 16 Gunstige verdeling van antibacteriële middelen in deze afgelegen locaties wordt geacht een belangrijke determinant van de werkzaamheid van tuberculose drugs te zijn. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen Johnson & Johnson, de TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X en Trius Therapeutics bedanken voor respectievelijk bedaquiline, PA-824 (pretomanide), AZD5847, radezolid en tedizolid. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li en Danielle Weiner verstrekten ondersteuning met MALDI analyse, bioanalytische methoden, voorbereiding van de caseum surrogaat, chemische synthese en isolatie van konijn caseum. Dit werk is uitgevoerd met financiering van de Bill en Melinda Gates Foundation, award # OPP1044966 en OPP1024050 aan V. Dartois, NIH Shared Instrumentation Grant S10OD018072, evenals gezamenlijke financiering van de Bill en Melinda Gates Foundation en Wellcome Trust voor een Center of Excellence Voor Leadoptimalisatie voor ziekten van de ontwikkelingswereld naar P. Wyatt.
Materials
| New Zealand White Rabbits | Covance | – | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
| RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hyclone L-glutamine, 200mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Cellstar TC dish, 145x20mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| Phorbol 12-myristate13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
| Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
| Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
| Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| PBS, pH7.4, 10 X 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | |
| Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
| Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
| 484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
| INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
| Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
| Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
| Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |
References
- Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
- Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).
- Aber, V. R., Nunn, A. J. Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy. Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).
- Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells. Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Sarathy, J. P., et al. Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions. ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).
- Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding. J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).
- Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma. J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).
- Liu, X., et al. Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid. Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).
- Able, S. L., et al. Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat. Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).
- Via, L. E., et al. Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates. Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).
- Kalvass, J. C., Maurer, T. S. Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery. Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).
- Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis. J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).
- Lenaerts, A. J., et al. Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910. Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
