Síntesis radioquímica automatizada de [¹⁸ F] 3F4AP: un nuevo trazador de PET para imágenes de enfermedades desmielinizantes

PRECAUCIÓN: Todos los procedimientos que involucren el uso de materiales radiactivos deben ser aprobados por la Oficina de Seguridad Radiológica local. Cuando trabaje con materiales radiactivos lleve una bata de laboratorio y placas de radiación personal. Utilice dos capas de guantes en todo momento y revise las manos con un contador Geiger después de cada paso que implica el manejo de la radiactividad. Si los guantes están contaminados con radiactividad, desechar y reemplazar los guantes externos. Utilice un blindaje apropiado, minimice el tiempo en contacto con la fuente de radiación y maximice la distancia. 1. Una semana antes del experimento: Preparación de materiales Descargar secuencia [ 18 F] 3F4AP: Los usuarios de Synthera pueden iniciar sesión en la Base de Datos de Usuarios (http://www.iba-radiopharmasolutions.com/products/chemistry) y descargar el archivo de secuencia para 3F4AP. Los usuarios de otros sintetizadores pueden necesitar escribir su propio script basado en la secuencia de pasos. Examine la secuencia anotada para familiarizarse con la secuencia sInvolucrados en la síntesis. Asegúrese de que haya suficiente gas para la síntesis. El sintetizador requiere gas comprimido, ya sea helio o nitrógeno. También requiere> 75 psi de aire comprimido. Asegúrese de que las presiones estén dentro de lo recomendado por el fabricante. Preparar fase móvil de HPLC: preparar 1 l de fosfato sódico 50 mM y trietilamina 10 mM. Usando un medidor de pH, ajuste el pH a 8,0 ± 0,1 añadiendo gota a gota hidróxido de sodio saturado mientras se agita. Filtrar la solución a través de un filtro de botella de 0,22 μm y añadir un 5% de volumen de etanol. Seque la cristalería en el horno durante la noche. 2. Día del Experimento: Antes de la llegada del Fluor-18 Utilizando jeringas de 1 ml, llene los frascos de reactivo con los reactivos apropiados. Para los viales 2 y 3, utilice viales secados en horno y disolventes anhidros mantenidos bajo argón. Sellar los frascos con sellos de rizado utilizando un rizador. Llene el Vial 1 (11 mm de diámetro / 2 ml de volumen viAl) con 400 μl de TBA-HCO3 + 800 μl de acetonitrilo (MeCN). Llene el Vial 2 (vial de 13 mm / 4 mL) con 50 μl de solución precursora 1,0 mg / mL + 450 μl de MeCN. Llene el Vial 3 (vial de 11 mm / 2 mL) con 500 μL de MeCN. Llene el Vial 4 (vial de 13 mm / 4 mL) con 4 mL de ácido oxálico al 0,2% en metanol (MeOH). Condicionar los cartuchos de extracción en fase sólida QMA (intercambio aniónico fuerte) y Alúmina-N. Utilizando una jeringa de 10 ml, pasar 5 ml de NaHCO3 al 8,4% gota a gota a través de la QMA seguido de 5 ml de agua desionizada de tipo I (18,2 ΜΩ • cm a 25 ºC). Pase 5 ml de agua ultrapura gota a gota a través de cartucho de Alúmina-N seguido por 5 ml de MeOH + ácido oxálico al 0,2%. Activar la HPLC y acondicionar la columna C-18 con 4 ml por minuto de fase móvil durante 30 min. Cargar un nuevo cartucho de catalizador en el soporte del cartucho del hidrogenador e iniciar un flujo de 0,5 ml / min de MeOH al 100%. SY el regulador de hidrógeno a 50 psi y acondicionar el cartucho durante 15 min ( Figura 2 ). Ensamble el procesador de fluido integrado (IFP) introduciendo los viales 1 a 4 en sus posiciones, uniendo los cartuchos y el vial de recolección como se muestra en la Figura 3 . Conecte un vial de recogida con una aguja de ventilación a la línea de salida del hidrogenador. Inicie el software del sintetizador. Introduzca el nombre de usuario y la contraseña. Realice verificaciones previas al sintetizador de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Haga clic en "Secuencias" y luego en "Abrir" para cargar la secuencia 3F4AP. Cargue el IFP haciendo clic en el botón "Cargar" en la pantalla. Escriba un nombre de archivo para la ejecución e inicie la secuencia haciendo clic en "Inicio". (El sintetizador automático se detendrá automáticamente antes del paso de carga de 18 F.) Observe como el sintetizador pasa por los pasos de autoverificación de rutina (parte uno de la secuencia). Mira el escudoN para asegurarse de que no hay advertencias ni alarmas. Preste atención a los sonidos como el sintetizador enjuaga las líneas y precalienta el recipiente de reacción en preparación para la ejecución. El indicador de temperatura debe elevarse y mantenerse a 65 ºC. Espere a que la señal (pitido auditivo) indique que el sintetizador está listo para la transferencia de 18 F. 3. Día del Experimento: 18 F Etiquetado Transferir de forma remota la cantidad deseada de 18F producido por ciclotrón desde el objetivo de ciclotrón hasta el vial de 18F. Verificar la cantidad de radiactividad y registrarla con el tiempo de entrega. NOTA: Si no usa una línea directa para la transferencia de 18 F , use una jeringa precargada con una aguja unida para transferir la actividad al vial a través del tabique. La cantidad de radiactividad de partida depende de los límites establecidos por la Oficina de Seguridad Radiológica y la cantidad deseada de trazador final. La cantidad típica oscila entre 50 y 500 mCi. <lI> Reanuda la secuencia en el sintetizador presionando "Reanudar". Esto iniciará la transferencia de los 18 F a la QMA. Supervisar la progresión de la síntesis a lo largo de la secuencia automatizada en la pantalla del ordenador. Observe la transferencia de los 18 F del vial a la QMA durante 90 s. Después de atrapar 18 F – on QMA se eluye con la solución de TBA – HCO 3 (vial 1). (Segunda parte de la secuencia) Controlar las trazas de presión y temperatura en el sintetizador, mientras que el TBA 18 F se seca a presión reducida (5 kPa) y calentamiento (100 ºC), seguido de pasos adicionales de secado y enfriamiento. (Parte 3 de la secuencia) Observar la transferencia de MeCN anhidro (vial 3) y solución precursora (vial 2) al reactor y cómo reacciona durante 1 min a temperatura ambiente. La solución debe ser de color incoloro o muy débil amarillo. (Parte 4 de la secuencia) Observe la transferencia de ácido oxálico(Vial 4) al reactor. Observe como la solución se transfiere de presión desde el reactor a través del cartucho de alúmina-N hasta el vial del producto final. (Parte 5 de la secuencia) Al final de la secuencia, imprima el informe, expulse el IFP, cierre los depósitos de gas y cierre el software. Mientras se establece el procedimiento, mida la radiactividad en el cartucho de alúmina-N y el vial de recogida introduciendo por separado el cartucho y el vial en el calibrador de dosis. Registre la actividad y el tiempo de medición. Coloque el cartucho usado en un contenedor de residuos con plomo. Coloque el vial de la colección en un contenedor blindado para su transporte al siguiente paso. Utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de 2 ", transfiera manualmente aproximadamente 100 μl de muestra de la solución del producto intermedio en un vial HPLC estándar para el control de calidad en proceso Inyecte 10 μL de esta muestra en la HPLC para evaluar la pureza y Identidad del intermeDiate. NOTA: Condiciones de HPLC: XDB 5 mu m, columna C _ {18} de 9,4 x 250 mm. Flujo 4 ml / min. Fase móvil (Na2HPO4 50 mM, TEA 10 mM, EtOH al 5%). Isocrático 15 min. 4. Día del Experimento: Hidrogenación PRECAUCIÓN: La inyección del producto en el hidrogenador tiene que ser hecha usando las precauciones apropiadas del blindaje. El gas de hidrógeno debe manejarse y ventilarse adecuadamente. NOTA: el reactor de hidrogenación puede ser conectado en lugar de la columna de HPLC en el sintetizador y controlado usando el software del sintetizador. Ajustar el flujo del hidrogenador a 0,5 ml / min iniciando la secuencia de HPLC del sintetizador. Ajuste manualmente la presión de hidrógeno a 50 psi. Después de terminar las etapas de etiquetado y apagado, el sintetizador transferirá la solución del producto intermedio al circuito hidrogenador / HPLC. Cuando el pico radiactivo aparece en el HPLC software alternar la válvula de recogida para recoger el producto. Medir la radiactividad del producto bruto utilizando un calibrador de dosis. NOTA: El producto bruto debe ser inyectado en un sistema automatizado de HPLC dentro de una celda caliente. Después de la purificación, el producto final se recoge y se distribuye en una pila aséptica ISO de clase 5 de flujo de aire laminar caliente según las regulaciones de USP y FDA. 5. Día del Experimento: Purificación y Preparación de la Dosis Inyectar el producto bruto en la HPLC y utilizar el colector de fracciones automatizado para recoger las fracciones correspondientes al pico del producto final. Cada tubo contiene 0,66 ml de solución. NOTA: Condiciones de HPLC: XDB 5 mu m, columna C _ {18} de 9,4 x 250 mm. Flujo 4 ml / min. Fase móvil (Na2HPO4 50 mM, TEA 10 mM, EtOH al 5%). Isocrático 15 min. Recoger 4-15 min. Mida la radioactividad de cada fracción usando un calibrador de dosis y anótelo. Combinar las fracciones con la cantidad más altaS de radioactividad (típicamente tubos 14-18). Dibujar la solución del producto con una jeringa de 10 ml y pasar la muestra a través de un filtro de 0,22 μm en un vial estéril. Anote la cantidad de radioactividad, el final del tiempo de síntesis y el volumen de la solución en la etiqueta del vial. Esta es la dosis final para la inyección. Ponga a un lado ~ 0,8 ml de la solución para las pruebas de control de calidad. 6. Día del Experimento: Pruebas de Control de Calidad (QC) Antes de la liberación de la dosis: Inspeccione la dosis a través de un cristal apantallado. La solución debe ser transparente, incolora y libre de partículas. Identidad radioquímica: Para RadioTLC: coloque una gota de la muestra en una placa de TLC lado a lado con el estándar de referencia. Ejecutar la placa de TLC en una cámara de TLC usando MeOH al 95%: ácido acético al 5%. Visualice el estándar de referencia bajo iluminación UV y marque su posición con lápiz. Cinta la placa de TLC a la etapa de la radioTLC scannY el tiempo de registro del pico. Los valores de Rf del patrón de referencia y del pico radiactivo deben coincidir en un 5%. Para RadioHPLC: ejecutar 10 μl de la dosis con y sin el patrón de referencia en la HPLC. El tiempo de retención del patrón de referencia y del pico radiactivo debe coincidir. Se debe observar un pico de coelución único en la muestra con punta. Para pureza radioquímica: medir el área bajo curva para los picos de radioHPLC y radioTLC. El área del pico objetivo debe ser> 95% del área para todos los picos radiactivos combinados. Para la radiactividad específica: calcule la radiactividad específica como la cantidad de radioactividad en el pico (medida en el paso 5.2) sobre la cantidad de masa determinada a partir del área bajo la curva de la traza UV HPLC usando una curva de calibración preestablecida. La radioactividad específica debe ser superior a 50 mCi / μmol. Para el análisis de disolventes residuales: medir la cantidad de solución residualTs (MeCN, MeOH) en la dosis usando cromatografía de gases. Los niveles de disolventes deben ser <0.04% para acetonitrilo y <3.000 ppm para metanol. La cantidad de EtOH debe ser inferior al 10% p / v. Para el ensayo de integridad del filtro estéril (punto de burbuja): conectar el filtro utilizado en el paso 5.3 a una alimentación de nitrógeno equipada con un regulador de presión y sumergir la aguja en agua. Abra gradualmente la válvula de gas mientras observa el manómetro. El filtro debe soportar presiones de hasta 50 psi sin estallar como lo demuestra la falta de una corriente de burbujas de la aguja. Aumentar la presión más allá de 50 psi hasta que una corriente de burbujas sale de la aguja. Registre esta presión, es la presión de ruptura y debe ser> 50 psi. Para la semivida del radionúclido: medir la radioactividad del producto en dos puntos de tiempo ≥ 10 min en un calibrador de dosis. Calcular la vida media utilizando la ecuación siguiente. La vida media debe coincidir con la de 18 F a 5 minutos (109 ± 5 min): T ½ calculado = 0.693 t ÷ ln (A 1 / A 2 ) Donde t es el intervalo entre mediciones y A 1 , A 2 la actividad medida en cada punto de tiempo. Para la identidad y pureza radionuclídicas: obtenga el espectro de rayos γ de una muestra del producto usando un contador gamma. El espectro debe presentar un solo pico de foto a una energía de 511 keV. No debería haber otros picos de foto en el espectro. Para el análisis de endotoxinas: medir los niveles de endotoxina usando una prueba de cuantificación de endotoxinas cromogénicas LAL. Los niveles de endotoxina deben ser <1,75 EU / mL para un producto diluido 1:10 con un volumen de producto final de 10 mL. Documentar los resultados de cada prueba de control de calidad. Soltar la dosis para estudios en animales sólo si todas las pruebas pasaron. Liberación después de la dosis: Para la prueba de esterilidad: añada una muestra de la dosis tanto al tioglicolato líquido como a la tripticasaCaldo de soja Después de 14 días, no hay crecimiento en los medios de comunicación. 7. Día del Experimento: Cálculos (Tabla 1) Para el rendimiento radioquímico corregido sin decaimiento (ndc RCY): calcule el ndc RCY como la cantidad de radiactividad en el producto final sobre la radiactividad de partida. Para la eficiencia del radiomarcado: calcule el rendimiento de etiquetado como la relación de la radiactividad en el vial de la colección sobre la radiactividad en el cartucho de N (no incorporado [ 18 F] F – ) y el vial de recogida. Para el rendimiento de hidrogenación: calcular el rendimiento de hidrogenación como la cantidad de radiactividad en el pico deseado sobre la radiactividad inyectada en la HPLC. Para las pérdidas de filtrado: calcule el filtrado pierde como la radiactividad que queda en el filtro y la jeringa sobre la radiactividad antes de filtrar.