Sintesi radiochimica automatizzata di [¹⁸ F] 3F4AP: un nuovo tracciante PET per le malattie Demyelinating di imaging

ATTENZIONE: Tutte le procedure che prevedono l'utilizzo di materiali radioattivi devono essere approvati dall'Ufficio locale per la radioprotezione. Quando si lavora con materiali radioattivi indossare un cappotto di laboratorio e distintivi di radiazioni personali. Usare sempre due strati di guanti e controllare le mani con un contatore Geiger dopo ogni passaggio che comporta la manipolazione della radioattività. Se i guanti sono contaminati con scorie radioattive e sostituire i guanti esterni. Utilizzare opportune schermature, ridurre al minimo il tempo a contatto con la sorgente di radiazione e massimizzare la distanza. 1. Una settimana prima dell'esperimento: preparazione dei materiali Scaricare la sequenza [ 18 F] 3F4AP: gli utenti di Synthera possono accedere al database degli utenti (http://www.iba-radiopharmasolutions.com/products/chemistry) e scaricare il file di sequenza per 3F4AP. Gli utenti di altri sintetizzatori potrebbero aver bisogno di scrivere il proprio script in base alla sequenza di passi. Sfoglia la sequenza annotata per familiarizzare con i sTappi coinvolti nella sintesi. Assicurarsi che ci sia abbastanza gas per la sintesi. Il sintetizzatore richiede gas compresso, sia elio che azoto. Richiede inoltre aria compressa> 75 psi. Assicurarsi che le pressioni siano all'interno del prodotto raccomandato dal costruttore. Preparare la fase mobile HPLC: preparare 1 L di 50 mM sodio fosfato e 10 mM trietilammina. Utilizzando un misuratore di pH regolare il pH a 8.0 ± 0.1 aggiungendo l'idrossido di sodio saturo in goccia mescolando. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da bottiglia da 0,22 μm e aggiungere 5% di etanolo. Vetrerie secchi nel forno durante la notte. 2. Giorno di sperimentazione: prima dell'arrivo di Fluorine-18 Utilizzando 1 ml di siringhe, riempire i flaconi del reagente con i reagenti appropriati. Per i flaconi 2 e 3 utilizzare flaconcini secchi e solventi anidro tenuti sotto argon. Sigillare i flaconi con le guarnizioni di crimpatura usando un crimpino. Riempire Vial 1 (diametro 11 mm / 2 ml volume viAl) con 400 μl di TBA-HCO 3 + 800 μL di acetonitrile (MeCN). Riempire il flaconcino 2 (flaconcino da 13 mm / 4 mL) con 50 μL di soluzione precursore 1,0 mg / ml + 450 μl di MeCN. Riempire il flaconcino 3 (flaconcino da 11 mm / 2 ml) con 500 μL di MeCN. Riempire il flaconcino 4 (flaconcino da 13 mm / 4 mL) con 4 mL di acido oxalico 0,2% in metanolo (MeOH). Condizione della cartuccia QMA (forte scambio di anioni) e Alumina-N. Usando una siringa da 10 ml, passare 5 mL di 8,4% di NaHCO 3 a goccia attraverso il QMA seguita da 5 mL di acqua ultrapure deionizzata tipo I (18,2 ΜΩ • cm a 25 ºC). Passare 5 ml di acqua ultrapure in goccia attraverso la cartuccia Alumina-N seguita da 5 ml di MeOH + 0,2% di acido ossalico. Accendere l'HPLC e condurre la colonna C-18 con 4 mL per min di fase mobile per 30 minuti. Caricare una nuova cartuccia del catalizzatore sul supporto della cartuccia idrogenatore e avviare un flusso di 0,5 mL / min di 100% MeOH. SE il regolatore di idrogeno a 50 psi e condizionare la cartuccia per 15 minuti ( figura 2 ). Montare il Processore Fluido Integrato (IFP) introducendo flaconi da 1 a 4 nelle loro posizioni, fissando le cartucce e il flaconcino di raccolta come mostrato in Figura 3 . Fissare una fiala di raccolta con un ago di sfiato alla linea di uscita dell'idrogeno. Avviare il software del sintetizzatore. Inserisci il login e la password. Eseguire i controlli di pre-esecuzione sul sintetizzatore in base alle istruzioni del produttore. Fare clic su "Sequences" e poi su "Open" per caricare la sequenza 3F4AP. Caricare l'IFP facendo clic sul pulsante "Carica" ​​sullo schermo. Digitare un nome di file per l'esecuzione e avviare la sequenza cliccando su "Start". (Il sintetizzatore automatico sospenderà automaticamente prima della fase di caricamento di 18 F.) Guarda come il sintetizzatore va attraverso i passaggi di autodiagnostica di routine (parte uno della sequenza). Guarda lo screeN per garantire che non ci siano allarmi o allarmi. Prestare attenzione ai suoni mentre il sintetizzatore scompare le linee e pre-riscalda il vaso di reazione in preparazione alla corsa. L'indicatore di temperatura dovrebbe salire e rimanere a 65 ºC. Attendere il segnale (segnale acustico) che indica che il sintetizzatore è pronto per il trasferimento da 18 F. 3. Giornata dell'esperimento: 18 F Etichettatura Trasferire in remoto la quantità desiderata di 18 ciclotrone prodotta dal target ciclotrone a una fiala da 18 F. Verificare la quantità di radioattività e registrarla con l'orario di consegna. NOTA: Se non si utilizza una linea diretta per 18 F trasferimento utilizzare una siringa pre-riempita con un ago attaccato per trasferire l'attività alla fiala attraverso il setto. La quantità di radioattività di partenza dipende dai limiti stabiliti dall'Ufficio di sicurezza delle radiazioni e dalla quantità di tracciante finale desiderata. La quantità tipica varia da 50 a 500 mCi. <lI> Riprendere la sequenza sul sintetizzatore premendo "Riprendi". Questo avvierà il trasferimento dei 18 F nel QMA. Monitorare la progressione della sintesi durante la sequenza automatica sullo schermo del computer. Guarda il trasferimento del 18 F dalla fiala sul QMA per 90 s. Dopo aver intrappolato 18 F – su QMA eluve con soluzione TBA-HCO 3 (flaconcino 1). (Parte seconda della sequenza) Monitorare le tracce di pressione e temperatura sul sintetizzatore mentre il TBA 18 F viene essiccato a pressione ridotta (5 kPa) e riscaldamento (100 ºC), seguita da ulteriori asciugatura e raffreddamento. (Parte 3 della sequenza) Osservare il trasferimento di MeCN anidride (flaconcino 3) e soluzione precursore (flaconcino 2) al reattore e come reagisce per 1 min a temperatura ambiente. La soluzione deve essere incolore o molto giallo debole. (Parte 4 della sequenza) Osservare il trasferimento dell'acido ossalicoSoluzione (flaconcino 4) al reattore. Guarda come la soluzione è la pressione trasferita dal reattore attraverso la cartuccia di allumina-N alla fiala del prodotto finale. (Parte 5 della sequenza) Alla fine della sequenza, stampare il rapporto, espellere l'IFP, arrestare i serbatoi di gas e chiudere il software. Prima di stabilire la procedura, misurare la radioattività nella cartuccia di allumina-N e nella fiala di raccolta introducendo separatamente la cartuccia e la fiala nel calibratore della dose. Registrare l'attività e il tempo di misurazione. Posizionare la cartuccia usata in un contenitore di residui di piombo. Posizionare il flaconcino di raccolta in un contenitore schermato per il trasporto al passo successivo. Utilizzando una siringa da 1 ml con un ago da 2 ", trasferire manualmente circa 100 μl di campione della soluzione di prodotto intermedio in un flacone HPLC standard per il controllo della qualità in processo. Iniettare 10 μL di questo campione nella HPLC per valutare la purezza e Identità dell'intermeComposto diattivo. NOTA: condizioni HPLC: colonna XDB 5 μm, 9,4 x 250 mm C18. Flusso 4 mL / min. Fase mobile (50 mM Na 2 HPO 4 , 10 mM TEA, 5% EtOH). Isocratico 15 min. 4. Giornata dell'esperimento: idrogenazione ATTENZIONE: L'iniezione del prodotto nell'idrogeno deve essere effettuata utilizzando adeguate precauzioni di schermatura. Il gas idrogeno deve essere adeguatamente manipolato e sfiato. NOTA: il reattore di idrogenazione può essere collegato al posto della colonna HPLC sul sintetizzatore e controllato utilizzando il software del sintetizzatore. Impostare il flusso dell'idrogenoatore a 0,5 mL / min iniziando la sequenza HPLC del sintetizzatore. Impostare manualmente la pressione dell'idrogeno a 50 psi. Dopo aver terminato i passaggi di etichettatura e di spegnimento, il sintetizzatore trasferirà la soluzione di prodotto intermedio in idrogeno / ciclo HPLC. Quando il picco radioattivo viene visualizzato sul HPLC software sposta la valvola di raccolta per raccogliere il prodotto. Misurare la radioattività del prodotto grezzo utilizzando un calibratore di dosaggio. NOTA: il prodotto grezzo dovrebbe essere iniettato in un sistema HPLC automatizzato all'interno di una cella calda. Dopo la purificazione, il prodotto finale viene quindi raccolto e dispensato in una cella ausiliaria fluida del flusso laminare classico classe 5 conformemente alle normative USP e FDA. 5. Giorno di sperimentazione: purificazione e preparazione del dosaggio Iniettare il prodotto grezzo nel HPLC e utilizzare il collettore di frazioni automatizzato per raccogliere le frazioni corrispondenti al picco del prodotto finale. Ogni tubo contiene 0,66 ml di soluzione. NOTA: condizioni HPLC: colonna XDB 5 μm, 9,4 x 250 mm C18. Flusso 4 mL / min. Fase mobile (50 mM Na 2 HPO 4 , 10 mM TEA, 5% EtOH). Isocratico 15 min. Raccogli 4-15 min. Misurare la radioattività di ciascuna frazione utilizzando un calibratore di dose e registrarla. Combinare le frazioni con la massima quantitàS di radioattività (tipicamente i tubi 14-18). Disegnare la soluzione del prodotto con una siringa da 10 ml e passare il campione attraverso un filtro da 0,22 μm in una fiala sterile. Registrare la quantità di radioattività, la fine del tempo di sintesi e il volume della soluzione sull'etichetta del flaconcino. Questa è la dose finale per l'iniezione. Mettere da parte ~ 0,8 ml della soluzione per i test di controllo di qualità. 6. Giorno di sperimentazione: Controlli di qualità (QC) Prima di rilasciare la dose: Ispezionare la dose attraverso un vetro schermato di piombo. La soluzione deve essere chiara, incolore e priva di particolato. Identità radiochimica: Per RadioTLC: posizionare una goccia del campione su una piastra TLC affiancata dalla norma di riferimento. Eseguire la lastra di TLC su una camera di TLC usando il 95% di MeOH: 5% di acido acetico. Visualizzare lo standard di riferimento sotto l'illuminazione UV e segnare la sua posizione con la matita. Nastri la lastra TLC allo stadio della scansione radioTLCEr e il tempo record del picco. I valori Rf dello standard di riferimento e il picco radioattivo devono corrispondere al 5%. Per RadioHPLC: eseguire 10 μL della dose con e senza lo standard di riferimento sul HPLC. Il tempo di ritenzione dello standard di riferimento e il picco radioattivo devono corrispondere. Sul campione tamponato deve essere visto un solo picco di coefficiente. Per la purezza radiochimica: misurare l'area sotto curva per i picchi di target radioHPLC e radioTLC. L'area del picco obiettivo deve essere> 95% della superficie per tutti i picchi radioattivi combinati. Per la radioattività specifica: calcolare la radioattività specifica come la quantità di radioattività nel picco (misurata alla fase 5.2) sulla quantità di massa determinata dall'area sotto la curva della traccia UV HPLC utilizzando una curva di calibrazione prestabilita. La radioattività specifica deve essere superiore a 50 mCi / μmol. Per l'analisi residua del solvente: misurare la quantità di solventi residuiTs (MeCN, MeOH) nella dose usando la cromatografia a gas. I livelli di solventi devono essere <0,04% per acetonitrile e <3,000 ppm per metanolo. La quantità di EtOH deve essere inferiore al 10% w / v. Per il test di integrità del filtro sterile (punto bolle): collegare il filtro utilizzato nella fase 5.3 ad una fornitura di azoto dotata di un regolatore di pressione e immergere l'ago in acqua. Aprire gradualmente la valvola del gas mentre si guarda il manometro. Il filtro deve resistere a pressioni fino a 50 psi senza scoppio, come dimostra la mancanza di un flusso di bolle dall'ago. Aumenta la pressione oltre i 50 psi finché un flusso di bolle esce dall'ago. Registrare questa pressione, è la pressione di scoppio e deve essere> 50 psi. Per l'emivita del radionuclide: misurare la radioattività del prodotto in due punti di tempo ≥10 min in un calibratore di dosaggio. Calcolare l'emivita utilizzando l'equazione seguente. L'emivita deve corrispondere a quella di 18 F entro 5 minuti (109 ± 5 min): T ½ calcolato = 0,693 t ÷ ln (A 1 / A 2 ) Dove t è l'intervallo tra le misurazioni e A 1 , A 2 l'attività misurata in ogni punto temporale. Per l'identità radionuclidica e la purezza: ottenere lo spettro di raggi gamma di un campione del prodotto utilizzando un contatore gamma. Lo spettro dovrebbe presentare una singola foto-picco ad un'energia di 511 keV. Non ci dovrebbero essere altre foto-picchi nello spettro. Per l'analisi dell'endotossina: misurare i livelli di endotossina usando un test quantitativo cromogenico di endotossina LAL. I livelli di endotossina devono essere <1.75 EU / mL per un prodotto diluito 1:10 con un volume finale del prodotto di 10 mL. Documentare i risultati di ciascun test QC. Rilasciare la dose per gli studi sugli animali solo se tutti i test sono passati. Sblocco post-dose: Per il test di sterilità: aggiungere un campione della dose sia al tioglicolato fluido che alla tripicinaBrodo di soia. Nessuna crescita deve essere visto sui media dopo 14 giorni. 7. Giorno dell'esperimento: calcoli (tabella 1) Per la resa radiochimica (ndc RCY) corretto di non decadimento: calcolare il ndc RCY come quantità di radioattività nel prodotto finale sulla radioattività di partenza. Per l'efficienza del radiolabel: calcolare la resa di etichettatura come rapporto di radioattività nel flaconcino di raccolta sulla radioattività nella cartuccia di allumina-N (non incorporata [ 18 F] F) e nella fiala di raccolta. Per la resa di idrogenazione: calcolare la resa di idrogenazione come la quantità di radioattività nel picco desiderato rispetto alla radioattività iniettata nella HPLC. Per le perdite di filtraggio: calcolare il filtraggio perde come la radioattività residua nel filtro e siringa sulla radioattività prima del filtraggio.