אוטומטי סינתזה Radiochemical של [<sup22</sup> F] 3F4AP: עוקב PET חדשנית עבור הדמיה מחלות Demyelinating
Summary
אנו מדגימים את הסינתזה הרדיו-כימית האוטומטית למחצה של [ 18 F] 3F4AP ונהלי בקרת איכות.
Abstract
3 [18F] fluoro-4-aminopyridine, [ 18 F] 3F4AP, הוא אנלוגי radiofluorinated של התרופה המאושרת על ידי ה- FDA לטרשת נפוצה 4-aminopyridine (4AP). מתחם זה נמצא כעת תחת חקירה כמו נותב PET עבור demyelination. תיארנו לאחרונה תגובה כימית חדשנית לייצר pyridines metafluorinated המורכב פלואור ישיר של פירידין N- תחמוצת וניצול של תגובה זו עבור סינתזה רדיוכימי של [ 18 F] 3F4AP. במאמר זה, אנו מדגימים כיצד לייצר את זה נותב באמצעות סינתיסייזר אוטומטי ו בתוך הבית עשה תזרים hydrogenation הכור. כמו כן, אנו מראים את נהלי בקרת האיכות הסטנדרטיים שבוצעו לפני שחרור מכשיר הרדיו למחקרים הדמיה פרה-קלינית בבעלי חיים. הליך חצי אוטומטי זה עשוי לשמש כבסיס לייצור עתידי של [ 18 F] 3F4AP למחקרים קליניים.
Introduction
היכולת לעקוב אחר תרופה קטנה מולקולה לא פולשנית בתוך גוף האדם יש פוטנציאל גדול כלפי הרפואה דיוק. בין טכניקות הדמיה מולקולארית, טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET) יש מאפיינים נוחים רבים: הרגישות הגבוהה של גלאי PET מאפשר זיהוי וכימות של כמויות קטנות מאוד של חומר רדיואקטיבי ואת המאפיינים של סורקים לאפשר מיפוי מרחבי מדויק של לוקליזציה התרופה 1 , 2 , 3 . לדוגמה, PET מאפשר זיהוי ולוקליזציה של גידולים וגרורות על בסיס ספיגה של אנלוגי גלוקוז רדיואקטיבי, [ 18 F] FDG 4 . PET יכול גם לספק לוקליזציה וכימות של קולטני המוח ספציפיים התפוסה שלהם אשר יכול להיות בעל ערך לאבחון ולהבנת הפרעות נוירולוגיות פסיכיאטריות 5 . כדי להתפתחמוליך קטן של מולקולה PET, תרכובת של עניין חייב להיות מתויג עם איזוטופ פוזיטרונים, בדרך כלל 11 C או 18 F. בין שתי רדיואיזוטופים אלה, 18 F יש מחצית חיים יותר (109 דקות לעומת 20.3 עבור 11 ג) , המאפשר רב מינון ייצור מחוץ לאתר. עם זאת, הוספת 18 F למולקולה יכול להיות מאתגר. 18 תיוג F דורש תגובות מהירות תואמות אוטומציה להקלת הכימאי של טיפול ישיר של פעילות וקבלת מינון קרינה גבוהה.
לאחרונה תיארנו את השימוש ב- N-oxides pyridine כמבשרים של פלואורינציה של pyridines ושימוש בכימיה זו בסינתזה רדיוכימית של [18F] 3F4AP 6 , אנלוגי radiofluorinated של התרופה שאושרה על ידי ה- FDA עבור טרשת נפוצה, Aminopyridine (4AP) 7 , 8 , 9 . תהוא radiotracer החדש נמצא כעת תחת חקירה כמו נותב PET עבור demyelination 10 , 11 , 12 . במאמר זה וידאו, אנו מדגימים את חצי אוטומטי סינתזה של המתחם הזה באמצעות יחידת סינתזה סינתזה IBA (להלן המכונה "סינתיסייזר") ו-בתוך הבית עשה זרימת הידרוגנציה המכשיר. הסינתזה מבוססת על התגובה המוצגת באיור 1 . ההכנה עבור ההליך לוקח כ 1 שעות, radiolabeling וטיהור 1.5 שעות ו בקרת איכות הליכים 0.5 ח.
Protocol
זהירות: כל ההליכים הכרוכים בשימוש בחומרים רדיואקטיביים חייבים להיות מאושרים על ידי המשרד המקומי לבטיחות קרינה. כאשר עובדים עם חומרים רדיואקטיביים ללבוש מעבדה מעבדה ותגי קרינה אישית. השתמש בשתי שכבות של כפפות בכל עת ולבדוק ידיים עם מונה Geiger לאחר כל צעד זה כרוך טיפול רדיואקטיביות. אם כפפות מזוהמות עם רדיואקטיביות להשליך ולהחליף כפפות החיצוני. השתמש מיגון מתאים, למזער את הזמן במגע עם מקור הקרינה למקסם את המרחק. 1. שבוע לפני הניסוי: הכנת חומרים הורדה [ 18 F] 3F4AP רצף: משתמשים Synthera יכול להיכנס למסד הנתונים משתמשים (http://www.iba-radiopharmasolutions.com/products/chemistry) ולהוריד את קובץ רצף עבור 3F4AP. משתמשים של סינתיסייזרים אחרים עשויים להזדקק לכתוב סקריפט משלהם על פי רצף הצעדים. דפדף ברצף המבואר כדי להכיר את sטפס מעורב בסינתזה. ודא שיש מספיק גז לסינתזה. סינתיסייזר דורש גז דחוס, או הליום או חנקן. זה דורש גם> 75 psi אוויר דחוס. ודא כי הלחצים הם בתוך המומלץ על ידי היצרן. הכן שלב נייד HPLC: להכין 1 ליטר של 50 מ"ל פוספט נתרן ו 10 meth triethyl אמין. באמצעות מד pH להתאים את ה- pH ל 8.0 ± 0.1 על ידי הוספת hydroxide נתרן ירידה רווי בזמן תוך ערבוב. סנן את הפתרון באמצעות מסנן בקבוק 0.22 מיקרומטר ולהוסיף נפח 5% של אתנול. כלי זכוכית יבשים בתנור בן לילה. 2. יום הניסוי: לפני ההגעה של פלואור -18 באמצעות 1 מזרקים מ"ל, למלא בקבוקונים מגיב עם ריאגנטים המתאימים. עבור בקבוקונים 2 ו 3 להשתמש בצנצנות מיובשים תנור ממיסים נטול מים תחת ארגון. חותם את צלוחיות עם חותמות crimp באמצעות crimper. מילוי בקבוקון 1 (11 מ"מ קוטר / 2 מ"ל נפח viאל) עם 400 μL של TBA-HCO 3 + 800 μL של אצטוניטריל (MeCN). מילוי בקבוקון 2 (13 מ"מ / 4 בקבוקון מ"ל) עם 50 μL של מבשר פתרון 1.0 מ"ג / מ"ל + 450 μL של MeCN. מילוי בקבוקון 3 (11 מ"מ / 2 בקבוקון מ"ל) עם 500 μL של MeCN. מילוי בקבוקון 4 (13 מ"מ / 4 בקבוקון מ"ל) עם 4 מ"ל של חומצה אוקסלית 0.2% מתנול (MeOH). תנאי QMA (חילופי אניון חזקה) ו Alumina-N מוצק מחסניות שלב החילוץ. באמצעות מזרק 10 מ"ל, לעבור 5 מ"ל של 8.4% NaHCO 3 ירידה חכם דרך QMA ואחריו 5 מ"ל של ultrapure deionized סוג אני מים (18.2 ΩΩ • ס"מ ב 25 מעלות צלזיוס). לעבור 5 מ"ל של מים ultrapure ירידה חכם באמצעות מחסנית אלומינה-N ואחריו 5 מ"ל של MeOH + 0.2% חומצה אוקסלית. הפעל את HPLC ואת מצב טור C-18 עם 4 מ"ל לכל דקה של השלב הנייד למשך 30 דקות. טען מחסנית זרז חדש על בעל מחסנית hydrogenator ולהתחיל זרימה של 0.5 מ"ל / דקה של 100% MeOH. SEt הרגולטור מימן ל 50 psi ולמצב את המחסנית במשך 15 דקות ( איור 2 ). להרכיב את מעבד נוזל משולב (IFP) על ידי הצגת בקבוקונים 1 עד 4 עמדות שלהם, לצרף את מחסניות בקבוקון איסוף כפי שמוצג באיור 3 . צרף בקבוקון אוסף עם מחט אוורור לקו הפלט של hydrogenator. הפעל את תוכנת הסינתיסייזר. הזן כניסה וסיסמה. בצע בדיקות מראש על הסינתיסייזר בהתאם להוראות היצרן. לחץ על "רצפים" ולאחר מכן על "פתח" כדי לטעון את רצף 3F4AP. טען את ה – IFP על ידי לחיצה על כפתור "Load" על המסך. הקלד שם קובץ להפעלה והתחל את הרצף על ידי לחיצה על "התחל". (הסינתיסייזר האוטומטי ישהה באופן אוטומטי לפני השלב 18 F טוען). שעונים כמו סינתיסייזר עובר את השגרה עצמית צעדים (החלק הראשון של הרצף). תראי את הסירהN כדי להבטיח כי אין אזהרות או אזעקות. שימו לב לצלילים כמו סינתיסייזר השטיפה קווים מראש כלי התגובה לקראת ההפעלה. מחוון הטמפרטורה צריך לעלות ולהישאר על 65 מעלות צלסיוס. המתן לאות (ביפ קולי) המציין שהסינתיסייזר מוכן להעברה של 18 F. 3. יום הניסוי: 18 F תיוג העברת מרחוק כמות רצויה של cyclotron המיוצרים 18 F מהיעד cyclotron כדי 18 V בקבוקון. אמת את כמות הרדיואקטיביות ורשום אותה בזמן המסירה. הערה: אם לא משתמשים בקו ישיר עבור 18 F – העברה, השתמשו במזרק טעון מראש עם מחט המחוברת להעברת הפעילות לבקבוקון דרך מחצה. כמות הרדיואקטיביות מתחילה בהתאם למגבלות שנקבעו על ידי משרד בטיחות הקרינה ואת הסכום הרצוי של נותב הסופי. כמות טיפוסי נע בין 50 ל 500 mCi. <lI> המשך רצף על הסינתיסייזר על ידי לחיצה על "חידוש". זה יהיה ליזום את העברת 18 F לתוך QMA. לפקח על התקדמות הסינתזה לאורך רצף אוטומטי על מסך המחשב. שעונים את העברת 18 F מן הבקבוקון על QMA עבור 90 s. לאחר השמנה 18 F – על QMA זה elutes עם TBA-HCO 3 פתרון (בקבוקון 1). (חלק שני של רצף) צג את הלחץ ואת טמפרטורות עקבות על סינתיסייזר בעוד TBA 18 F מיובש תחת לחץ מופחת (5 kPa) וחימום (100 מעלות צלזיוס), ואחריו ייבוש נוסף להתקרר צעדים. (חלק 3 של רצף) צפה בהעברת MeCN נטול מים (בקבוקון 3) ו מבשר פתרון (בקבוקון 2) לכור וכיצד הוא מגיב במשך דקה 1 בטמפרטורת החדר. הפתרון צריך להיות צהוב או צהוב חלש מאוד. (חלק 4 של רצף) צפה בהעברת חומצה אוקסליתפתרון (בקבוקון 4) על הכור. צפה כפתרון מועבר הלחץ מהכור באמצעות מחסנית אלומינה N אל בקבוקון המוצר הסופי. (חלק 5 של רצף) בסוף הרצף, להדפיס את הדו"ח, להוציא את IFP, לסגור את מיכלי הדלק, ולסגור את התוכנה. בעוד הראשון הקמת ההליך, למדוד את הרדיואקטיביות של מחסנית אלומינה-N ואת בקבוקון איסוף ידי בנפרד מציגה את המחסנית בקבוקון במינון את המינון. הקלט את הפעילות ואת זמן המדידה. מניחים את המחסנית המשמשת במיכל פסולת עופרת. מניחים את בקבוקון איסוף במיכל מוגן להובלה לשלב הבא. באמצעות מזרק 1 מ"ל עם 2 "המחט המצורפת, באופן ידני להעביר כ 100 μL של מדגם של פתרון מוצר ביניים לתוך בקבוקון HPLC סטנדרטי עבור בקרת איכות בתהליך.להזריק 10 μL של מדגם זה לתוך HPLC כדי להעריך את הטוהר הזהות של intermeתרכובת. הערה: תנאים HPLC: XDB 5 מיקרומטר, 9.4 x 250 מ"מ C18 טור. תזרים 4 מ"ל / דקות. שלב נייד (50 מ"מ Na 2 HPO 4 , 10 מ"מ TEA, EtOH 5%). Isocratic 15 דקות. 4. יום הניסוי: הידרוגנציה זהירות: הזרקת המוצר לתוך המימן חייבת להיעשות תוך שימוש באמצעי זהירות נאותים. גז המימן חייב להיות מטופל כראוי ו fented. הערה: הכור הידרוגני יכול להיות מחובר במקום עמודה HPLC על סינתיסייזר ושליטה באמצעות תוכנת סינתיסייזר. הגדר את זרימת hydrogenator ב 0.5 מ"ל / דקה על ידי הפעלת רצף HPLC סינתיסייזר. ידנית להגדיר לחץ מימן ל 50 psi. לאחר שסיים את התיוג ואת מרווה צעדים סינתיסייזר יעביר את הפתרון מוצר ביניים לתוך hydrogenator / HPLC לולאה. כאשר השיא הרדיואקטיבי מופיע ב- HPLC התוכנה להחליף את שסתום אוסף לאסוף את המוצר. מדידת רדיואקטיביות של מוצר גולמי באמצעות מינון של המינון. הערה: יש להזריק את המוצר הגולמי למערכת אוטומטית של HPLC בתוך תא חם. לאחר טיהור, המוצר הסופי הוא נאסף מכן ו dispensed לתוך ISO ברמה aseptic 5 זרימת אוויר למינרית תא חם לפי תקנות USP ו- FDA. 5. יום הניסוי: טיהור והכנה של המינון להזריק מוצר גולמי לתוך HPLC ולהשתמש אספן חלק אוטומטי לאסוף את השברים המתאימים לשיא המוצר הסופי. כל צינור מכיל 0.66 מ"ל של פתרון. הערה: תנאים HPLC: XDB 5 מיקרומטר, 9.4 x 250 מ"מ C18 טור. תזרים 4 מ"ל / דקות. שלב נייד (50 מ"מ Na 2 HPO 4 , 10 מ"מ TEA, EtOH 5%). Isocratic 15 דקות. איסוף 4-15 דקות. למדוד את הרדיואקטיביות של כל חלק באמצעות מינון מנה להקליט אותו. שלב את השברים עם הסכום הגבוה ביותרS של רדיואקטיביות (בדרך כלל צינורות 14-18). צייר את פתרון המוצר עם מזרק 10 מ"ל ולהעביר את המדגם באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוקון סטרילית. הקלט את כמות הרדיואקטיביות, סיים את זמן הסינתזה ואת נפח הפתרון על תווית הבקבוקון. זוהי המינון הסופי להזרקה. לשים בצד ~ 0.8 מ"ל של הפתרון לבדיקות בקרת איכות. 6. יום הניסוי: בקרת איכות (QC) בדיקות לפני שחרור המינון: בדוק את המינון באמצעות זכוכית מסוכך. הפתרון צריך להיות ברור, חסר צבע וללא חומר חלקיקי. זהות רדיוכימית: עבור RadioTLC: נקודה ירידה של המדגם על צלחת TLC בצד לצד עם תקן התייחסות. הפעל צלחת TLC על תא TLC באמצעות 95% MeOH: חומצה אצטית 5%. דמיינו את תקן הייחוס תחת תאורה UV וסימנו את מיקומו בעיפרון. קלטת את צלחת TLC על הבמה של radioTLC scannאה ו שיא הזמן של השיא. ערכי F של תקן הייחוס והשיא הרדיואקטיבי חייבים להיות תואמים בתוך 5%. עבור RadioHPLC: לרוץ 10 μL של המינון עם וללא תקן התייחסות על HPLC. שעת ההחזקה של תקן הייחוס ושל השיא הרדיואקטיבי חייבת להתאים. שיא יחיד coelution יש לראות על המדגם ממוסמר. עבור טוהר רדיואקטיבי: למדוד את האזור תחת עקומת עבור radioHPLC ו radioTLC היעד peaks. השטח של שיא היעד צריך להיות> 95% של האזור עבור כל פסגות רדיואקטיבי משולב. עבור רדיואקטיביות ספציפית: לחשב את הרדיואקטיביות הספציפית ככמות הרדיואקטיביות בשיא (נמדדת על שלב 5.2) על כמות המסה שנקבעה מהאזור תחת עקומת עקבות HPLC UV באמצעות עקומת כיול מראש. הרדיואקטיביות הספציפית חייבת להיות גבוהה מ -50 mCi / μmol. עבור ניתוח ממס שיורית: למדוד את כמות שיורית solvenTs (MeCN, MeOH) במינון באמצעות כרומטוגרפיה גז. רמות ממיסים חייבים להיות <0.04% עבור אצטוניטריל ו- <3,000 ppm עבור מתנול. כמות EtOH חייב להיות פחות מ 10% w / v. עבור בדיקת שלמות מסנן סטרילית (נקודה בועה): לחבר את המסנן בשימוש בשלב 5.3 לאספקת חנקן מצויד וסת לחץ ו להטביע את המחט במים. פתח את שסתום הגז בהדרגה תוך כדי צפייה במד הלחץ. המסנן צריך לעמוד בלחצים של עד 50 psi ללא התפוצצות, כפי שמעידים העדר זרם של בועות מהמחט. להגדיל את הלחץ מעבר 50 psi עד זרם של בועות יוצא המחט. להקליט את הלחץ הזה, זה הלחץ פרץ וזה חייב להיות> 50 psi. במשך חצי-חיים של הרדיונוקלידים: מדדו את הרדיואקטיביות של המוצר בנקודות זמן של 10 דקות במינון של מינון. חישוב מחצית החיים באמצעות המשוואה להלן. מחצית החיים חייבת להתאים לזה של 18 F עד 5 דקות (10)9 ± 5 דקות): T ½ מחושב = 0.693 t ÷ ln (A 1 / A 2 ) כאשר t הוא המרווח בין המדידות לבין A 1 , A 2 הפעילות הנמדדת בכל נקודת זמן. לקבלת הזהות והרדיאוקלידיק: השג את ספקטרום הגלם γ של מדגם של המוצר באמצעות מונה גמא. הספקטרום צריך להציג תמונה אחת שיא באנרגיה של 511 keV. לא צריך להיות שום אחרים צילום peaks בספקטרום. לניתוח אנדוטוקסין: למדוד את רמות האנדוטוקסין באמצעות בדיקה כימית אנדוטוקסין chromogenic LAL. רמות אנדוטוקסי חייב להיות <1.75 EU / mL עבור מוצר בדילול 01:10 עם נפח מוצר סופי של 10 מ"ל. לתעד את התוצאות של כל מבחן QC. שחרר את המינון למחקרים בבעלי חיים רק אם כל הבדיקות עברו. שחרור לאחר המינון: עבור בדיקת סטריליות: להוסיף מדגם של מינון הן thioglycolate נוזלי ו trypticaseמרק סויה. אחרי 14 ימים לא נראה שום גידול בתקשורת. 7. יום הניסוי: חישובים (טבלה 1) עבור הלא דעיכה תיקון תשואה רדיואקטיבית (ndc RCY): לחשב את RCY ndc כמו כמות הרדיואקטיביות במוצר הסופי על פני רדיואקטיביות החל. ליעילות רדיואקטיביות: לחשב את התשואה תיוג כמו היחס של רדיואקטיביות בבקבוקון אוסף מעל רדיואקטיביות של מחסנית alumina-N (מאוגדים [ 18 F] F – ) ואת בקבוקון אוסף. עבור תשואה הידרוגנציה: לחשב את התשואה hydrogenation כמו כמות הרדיואקטיביות בשיא הרצוי על הרדיואקטיביות מוזרק לתוך HPLC. עבור הפסדים סינון: לחשב סינון מאבד כמו הרדיואקטיביות שנותרו המסנן מזרק על רדיואקטיביות לפני סינון.
Representative Results
סינתזה רדיוכימית של [ 18 F] 3F4AP מורכב שני שלבים ( איור 1 ). הצעד הראשון מתבצע באופן אוטומטי לחלוטין באמצעות יחידת סינתזה ( איור 3 ). מערכת זו מבוססת קלטת משתמשת ארבע בקבוקונים מגיב הבקבוק הכור אחד ויש לו שסתומים מבוקרים מחשב המאפשרים העברת ערבוב של ריאגנטים כמו גם חימום, בלחץ ופינוי הכור. בנוסף, הוא תומך סטנדרטי שלב מוצק מחסניות להפריד של ריאגנטים. ממשק המחשב מאפשר למשתמשים לכתוב ולשנות סקריפטים על מנת להפעיל סינתזות משלהם. במקרה של [FF] 3F4AP, הליך הסינתזה מורכב מחמישה חלקים בסיסיים. בחלק הראשון, הסינתיסייזר מבצע פעולות בדיקה עצמית, מחמם את הכור ומחכה לאות של מפעיל שה – 18 F מוכן. במהלך החלק השני, [ 18 F] פלואוריד מועבר הלוך ושובמ 'בקבוקון 18 F לתוך מחסנית אניון החליפין eluted מן המחסנית לתוך הכור באמצעות פתרון tetrabutyl אמוניום ביקרבונט. החלק השלישי, סינתיסייזר azeotropically dries את [ 18 F] פלואוריד תחת ואקום כדי להפוך אותו תגובתי לעבר עקירה נוקלאופילי. בחלק הרביעי, מבשר נוסף באופן אוטומטי לכור שבו הוא מגיב עם 18 F – כדי ליצור את המתחם שכותרתו. לבסוף, התגובה היא הרווה על ידי תוספת של 0.2% חומצה אוקסלית ב מתנול, אשר מונע פירוק מקדם בסיס של המוצר, והפתרון הסופי הוא לחץ מועבר בקבוקון איסוף לאחר שעבר דרך מחסנית אלומינה N כי מלכודות פלואוריד בלתי ממוחזר. לאחר שלב תיוג הושלמה מדגם קטן ניתן לנקוט עבור בקרת איכות. הפעלת מדגם על HPLC מספק אישור כי צעד תיוג עבד estatiעל הטוהר רדיוכימי ( איור 4 ). כמו כן, מן עקבות UV על HPLC כמות המונית של המוצר ניתן לחשב באמצעות עקומת כיול מראש. בעוד בתהליך בקרת איכות HPLC פועל, צעד התגובה השני, הפחתה של N- תחמוצת קבוצות ניטרו, מבוצעת. כדי לעשות זאת, המוצר שכותרתו מוזרק באופן אוטומטי לתוך מכשיר הידרוגנציה בתוך הבית מבוסס על השיטה שפורסמה על ידי Yoswathananont et al. 13 ( איור 2 ). התקן זה מורכב משאבת HPLC ומיכל מימן דחוס המחובר להתקן הידרוגנציה באמצעות קווים המצוידים בשסתומי בדיקה כדי למנוע הזרמה אחורית. המוצר נדחף על ידי משאבת HPLC מעורבב עם מימן במערבב בצורת T. תערובת זו מועברת מכן באמצעות מחסנית קטנה המכילה 10% Pd / C זרז על תמיכה מוצקה. אחרי שעבר דרך cataLyst המוצר מופחת נאסף אז שברים קטנים. בעקבות הידרוגנציה, המוצר הגולמי מועבר מוזרק באופן ידני לתוך HPLC לטיהור של המוצר הסופי ( איור 5 ). השלב הנייד של HPLC נבחרה להיות תואם להזרקת בעלי חיים. פסגות המתאימות למוצר נאספים ואז מסוננים מעוקרים כדי לקבל את המינון הסופי. לפני שחרור המינון עבור מחקרים הדמיה PET, בדיקות בקרת איכות מבוצעות. בדיקות אלה מבוצעות על מנת להבטיח כי נותב הוא ישות כימית שהיא אמורה להיות וכי זה בטוח להזרקת. חלק מהבדיקות הללו לא יידרשו להזרקת בעלי חיים, אך מומלץ בדרך כלל לעקוב אחר הנחיות השימוש האנושי. פעולה זו מבטיחה איכות של המוצר, אשר מגביר את אמון התוצאות ואת מאוד facמעביר את המעבר העתידי לייצור המוצר להזרקת אדם. טבלה 1 כוללת את הפרמטרים סינתזה טיפוסית כולל רדיואקטיביות כמות הראשונית, כמות ראשונית של מבשר, תשואה עבור כל צעד, פעילות ספציפית, סינון מאבד, וכו ' פרמטרים אלה הם שימושיים לפתרון בעיות תקלות מזדמנים ואופטימיזציה בעתיד של ההליך. איור 1. תרשים התגובה. סינתזה רדיוכימית מורכבת תיוג על ידי 19 F / 18 F חילופי ואחריו הידרוגנציה פלדיום מזוקק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" Src = "/ files / ftp_upload / 55537 / 55537fig2.jpg" /> איור 2. מערכת הידרוגנציה. סכמטי של המכשיר. מכשיר זה מבוסס על פרסום על ידי Yoswathananont et al. (נ"צ). איור 3. Scheme של סינתיסייזר משולב מעבד fluidic (IFP) ו ריאגנטים. IFP מכיל ארבעה בקבוקונים מגיב, מחסנית QMA ו בקבוק אחד הכור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4. UV ו traHers radioHPLC עבור המוצר ביניים. 3-fluoro-4-nitropyridine N- תחמוצת יש ספיגה אופיינית ב 313 ננומטר.E.jove.com/files/ftp_upload/55537/55537fig4large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 5. UV ו traHers radioHPLC עבור המוצר הסופי. 3-fluoro-4-aminoopyridine סופג ב 254 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. מוּשָׂג ממוצע (n = 4) SD הערות פעילות ראשונית של 18 F (mCi) 148.0 44.9 התחלה של סינתזה כמות מבשר (μg) 50 </tD> השתמש 50 μL של 1.0 מ"ג / מ"ל המניות הפעילות שנותרה ב- QMA (mCi) 3.0 1.7 נמדד בסוף שלב תיוג תשואה Radiolabeling 29.7% 6.3% Act_collection_vial ÷ (Act_collection_vial + Act_AluN) טוהר רדיוכימי (HPLC-1) > 98% מ HPLC-1 QC מפרט. פעולה. ביניים (mCi / μmol) 122.9 29.7 מ HPLC-1 באמצעות עקומת כיול התאוששות הידרוגנציה (dc) 74% 9.0% תוקן עבור ריקבון טוהר HPLC רדיואקטיבי (HPLC-2) 90.7% 2.9% מחושב מ- HPLC-2 יעילות ייבוש > 98% תוקן עבור ריקבון סינון התאוששות 93.5% 1.7% תוקן עבור ריקבון נפח המינון (מ"ל) 3.3 איסוף שברים עם רדיואקטיביות הגבוהה ביותר מפרט. פעולה. המוצר הסופי (mCi / μmol) 75.5 30.0 מ HPLC-3 באמצעות עקומת כיול יעילות סינתזה 8.5% 3.6% ללא דעיכה תיקון זמן סינתזה (דקות) 104 11.2 טבלה 1. פרמטרים סינתזה רדיוכימיים. בעיות נפוצות סיבות אפשריות ופתרונות [ 18 F] פלואוריד אינו יעיל eluted מ QMA · TBA-HCO 3 לא הוכנה כראוי. ודא ריכוז מספיק. · יש דליפות על הבקבוקון TBA-HCO 3 . ודא את החותם סתום הוא הדוק מחצה לא פירסינג לפני התקנת אותו על IFP. · TBA-HCO 3 אינו במצב טוב. להזמין אצווה חדשה. תיוג תיוג נמוך · יש לחות ב מבשר פתרון. יבש מבשרי וממיסים. · הטמפרטורה נמוכה מדי. פתרון התגובה הוא צהוב · המוצר מתפרק בשל הבסיס. השתמש פחות TBA-HCO 3 . · יש tמבשר הרבה. השתמש פחות מבשר. · יש מעט מדי ממס עבור כמות של 18 F – . השתמש יותר ממס. פסגות נוספות ברדיו · Nitro הקבוצה מוחלפת: להפחית את טמפרטורת התגובה או לקצר את זמן התגובה. תגובה הידרוגנציה לא עובד קטליסט אינו טוב. השתמש במחסנית חדשה. · זרימה מהירה מדי ואינה מאפשרת מגע מספיק בין הזרז לבין המצע. צמצום הזרימה. לחץ מימן נמוך מדי. להגביר את הלחץ H 2 . לחץ מימן עולה באופן דרמטי במהלך ההליך · שלמות המחסנית נפגעת ותמיכה מוצקה סותמת את השורות. עצור את הזרימה וסגר את הגז. בואו הרדיואקטיביות ריקבון. הסר מחסנית זרז ולשטוף את המערכת. שיםמחסנית. מימן תשואה נמוכה · יותר מדי זיהומים מתחרים על הזרז (MeCN, חומצה אוקסלית). ירידה כמות זיהומים או להגדיל מסה של מבשר (אזהרה: הגדלת כמות מבשר תפחית פעילות ספציפית). התאוששות של רדיואקטיביות משלב הידרוגנציה הוא נמוך · יש דליפה במערכת. בדוק דליפות ו backflush לתוך קו המימן. · מתחם מפחית את הכור בכור. להעריך תנאי תגובה שונים (לחץ, טמפרטורה, זרימה, וכו ' ). יותר מדי רדיואקטיביות אובדת במהלך הסינון • הרטיבו את המסנן לפני השימוש. · השתמש במסנן עם נפח מת קטן יותר. שיא המוצר הסופי על HPLC נראה רחב · יותר מדי נפח מוזרק. להזריק AM נמוך יותראונט. השתמש בעמודה עם קוטר גדול יותר. · הטור אינו מותנה היטב. תנאי העמודה עבור 30 כרכים לפחות. · PH של השלב הנייד הוא נמוך. ודא כי pH ≥ 8. · הטור אינו במצב טוב. החלף עמודה. השתמש בעמודה התואמת ל- pH בסיסי. טבלה 2. מדריך לפתרון בעיות.
Discussion
הכנה של שבבים PET דורש תיוג יעיל עם התערבות המשתמש מינימלית כדי למזער את החשיפה לקרינה 14 . כאן, תיארנו את ההליך חצי אוטומטי אוטומטי עבור סינתזה רדיוכימיים של [ 18 F] 3F4AP, נותב PET כעת תחת חקירה עבור demyelination הדמיה. שיטה חצי אוטומטית זו מייצרת את רדיוטראסר עם טוהר גבוהה ופעילות ספציפית מספקת ללימודי בעלי חיים. שיטות קודמות לסינתזה של תרכובת זו הסתמכה על סינתזה ידנית 6 , אשר מגביל באופן משמעותי את כמות נותב רדיואקטיבי שניתן לייצר. לאחר שיטה אוטומטית לסינתזה גם מספק תשואות לשחזור יותר ומקלה להעביר את הנוהל למעבדות אחרות עם ציוד דומה. מאמצים עתידיים כדי להפוך את התהליך באופן מלא יהיה אינסטרומנטלי לייצור של נותב בכמויות גבוהות עבור מחקרים בבעלי חיים גדולים או בני אדם.
<p cLass = "jove_content"> הליך זה משתמש בחילופי נוקלאופילים של 19 F עבור 18 F כדי לשלב את הרדיו-איזוטופ במולקולה של עניין. היתרונות של תגובה זו הם כי היא מהירה מייצרת כמעט אך ורק את המוצר הרצוי ללא צורך לבצע צעד טיהור ארוך כדי להסיר עודף של מבשר. מגבלה אחת של שימוש בתגובות פלואוריד-תיוג, כגון זו המשמשת כאן היא כי בשל המסה הראשונית של מתחם קר, הפעילות הסופית המוגדרת כסכום של רדיואקטיביות ב- mCi על כמות התרכובת ב- μmol עשויה להיות מוגבלת. תחת התנאים הרגילים שלנו, החל 100-200 mCi של 18 F – ו 50 מיקרוגרם של מבשר, הפעילות הספציפית טיפוסית בסוף הסינתזה היא עד 100-200 mCi / μmol, אשר נראה מספיק עבור מחקרים קליניים PET הדמיה . עם זאת, הפעילות הספציפית עשויה להשתפר על ידי הגדלת הסכום ההתחלתי עבור 18 F – </suP> תוך שמירה על כמות המסה נמוכה. היו מספר דיווחים על הפקת רדיוליגנים על ידי החלפת פלואוריד עם פעילות ספציפית גבוהה (1-3 Ci / μmol) על ידי הפעלת פעילות גבוהה וכמויות מבשר נמוך 15 , 16 .כמו עם כל סינתזות רדיוכימיים של trachers PET, זה קריטי לעבוד במהירות על מנת למזער ריקבון רדיואקטיבי. חשוב גם למזער את הזמן בטיפול בחומרים רדיואקטיביים, להשתמש מיגון נאות למקסם את המרחק בין חומר רדיואקטיבי לבין המשתמש כדי למזער את החשיפה לקרינה. היבטים אלה חשובים במיוחד במחצית השנייה של פרוטוקול (טיהור ובקרת איכות) שבו המשתמש צריך להזריק ידנית את הפתרון לתוך HPLC, לאסוף את השברים ולסנן את המוצר הסופי.
כמו עם כל synoceses רדיוכימיים של tracers PET, זה קריטי לעבוד במהירות כדי מ 'לעורר ריקבון רדיואקטיבי. חשוב גם למזער את הזמן בטיפול בחומרים רדיואקטיביים, להשתמש מיגון נאות למקסם את המרחק בין חומר רדיואקטיבי לבין המשתמש כדי למזער את החשיפה לקרינה. היבטים אלה חשובים במיוחד במהלך המחצית השנייה של פרוטוקול (הידרוגציה וטיהור) שבו המשתמש צריך להזריק ידנית את הפתרון לתוך hydrogenator, לאסוף את השברים, להגדיר את הליך הייבוש, redissolve את המוצר למאגר ולסנן אותו. במהלך שלב הסינון קל לאבד כמות גדולה של חומר רדיואקטיבי בקירות הבקבוקים. לכן, חשוב לנסות לאסוף את כל הנוזל לפני סינון. שימוש בכמות גדולה יותר של חיץ כדי לפזר עשוי לשפר את התשואה של ההתאוששות אבל השימוש בו הוא discouraged כי זה ידרוש הזרקת נפח גדול על HPLC, גרימת שיא להרחיב ולהגדיל את נפח המינון הסופי.
כדי לפתור את הבעיהNd לייעל את ההליך חשוב לעקוב אחר התשואות של כל צעד. עבור רוב השלבים זה נעשה פשוט על ידי מדידת כמות הרדיואקטיביות לפני ואחרי כל צעד. במקרה של התגובה התשואות ניתן לחשב באמצעות כימות של פסגות HPLC. טבלה 1 בפרק התוצאות מציגה את התשואות האופייניות לכל שלב. טבלה 2 להלן מפרטת רבות מהכישלונות הנפוצים ביותר עם סיבות אפשריות לכישלון וכיצד לתקן אותם.
לבסוף, למרות שהתהליך שהוכח כאן הוא ספציפי לסינתזה של [F 18 ] 3F4AP, זרימת העבודה הכללית ורבים מהשלבים האינדיבידואלים משותפים לסינתזה של תרכובות אחרות. במאמר זה אנו גם הוכיחו את בדיקות QC טיפוסי שבוצע על כל נותב PET.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה נתמך על ידי מענקים NIH / NIBIB 1K99EB020075 כדי פדרו Brugarolas וקרן קרן חדשנות של שיקגו חדשנות Exchange בריאן Popko ו פדרו Brugarolas. פרופ 'בריאן Popko מודה בהכרת תודה על mentorship שלו ותמיכה כספית לפרויקט. פרופ 'צ'ין-טו צ'ן והקרן המשולבת לחקר הדמיה של בעלי חיים קטנים באוניברסיטת שיקגו מודים על שיתוף נדיב של חלל מעבדה וציוד. IBA הוא הודה על מתן חסות פתוח של מאמר זה.
Materials
| Cyclotron produced [18F]fluoride | House supplied/Zevacor | IBA Cyclone 18 | 100-200 mCi |
| Integrated fluid processor for production FLT/FDG | ABX | K-2715SYN | Cassette used for nucleophilic substitution |
| Anhydrous acetonitrile | Janssen | 36431-0010 | Transfer under nitrogen |
| Methanol | Janssen | 67-56-1 | |
| ultrapure water | house supplied | Millipore MilliQ system | |
| TBA-HCO3 | ABX | 808.0000.6 | abx.de |
| QMA | Waters | WAT023525 | Quaternary methyl ammonium: Anion exchange solid phase extraction cartridge for trap and release of 18F- from the target water |
| Sodium bicarbonate | ABX | K-28XX.03 | Prefilled 5 mL syringes |
| Alumina-N | Waters | WAT020510 | Alumina-N solid phase extraction cartridge (for trapping unreacted 18F-) |
| 3-fluoro-4-nitropyridine N-oxide | Synthonix | 76954-0 | Store in desicator. Precursor |
| 3-fluoro-4-aminopyridine | Sigma Aldrich | 704490-1G | Reference standard |
| Oxalic acid | Sigma Aldrich | 75688-50G | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | S80191-1 | |
| Triethyl amine | Fisher Scientific | 04885-1 | |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | USP |
| Final product vial | ABX | K28XX.04 | |
| Millex Filter Syringe | Millex | SLGVR04NL | |
| 10% Pd/C cartridge | Sigma Aldrich | THS-01111-12EA | |
| 11 mm vials + crimp seals | Fisher Scientific | 03-250-618, 06-451-117, or equivalent | |
| 13 mm vials + crimp seals | Fisher Scientific | 06-718-992, 06-718-643, or equivalent | |
| HPLC vials | Fisher Scientific | 03-391-16, 03-391-17, or equivalent | |
| SEMIPREP C18 column | Agilent | 990967-202 | |
| V-vials | Alltech | ||
| Syringes: 1, 3, 10 mL | Fisher Scientific | 14-829-10D, 14-829-13Q, 14-829-18G, or equivalent | |
| Compressed gases: N2, He, H2 | Airgas | UHP N300, UHP HE300, UHP H300, or equivalent | |
| TLC plates | Sigma Aldrich | Z193275, or equivalent | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synthera automated synthesizer | IBA SA, Belgium, iba-worldwide.com | Synthera, 250.001 | Automatic synthesis unit |
| In-house hydrogenator | See picture | See text description | |
| Hot cells | Comecer | For manipulating radioactive materials | |
| RadioTLC scanner | Eckert and Ziegler | For handling sterile materials | |
| HPLC | Dionex | Ultimate 3000 | |
| Dose calibrator | Capintec | CRC15 | Or equivalent |
| Gamma counter | Capintec, 7 Vreeland Road, Florham Park, NJ 07932 | CRC 15, PET-CRC25, or equivalent | For measuring radioactivity |
| Personal dosimeters | Packard | Cobra II | For measuring gamma spectrum |
| Personal radiation badges and rings | Atlantic Nuclear | Rados Rad-60 Electronic Dosimeter, or equivalent | |
| Rotavap + vacuum pump | Landauer | ||
| Lead pigs + syringe shields | Heidolph | Or equivalent | |
| Geiger counters | Pinestar | ||
| Ludlum | Model 3 + Pancake GM detector, 4801605, 47-1539, or equivalent |
References
- Valk, P. E. . Positron emission tomography : basic science and clinical practice. , (2003).
- Phelps, M. E. . PET: molecular imaging and its biological applications. , (2004).
- Ametamey, S. M., Honer, M., Schubiger, P. A. Molecular imaging with PET. Chem Rev. 108 (5), 1501-1516 (2008).
- Oriuchi, N., et al. Present role and future prospects of positron emission tomography in clinical oncology. Cancer Sci. 97 (12), 1291-1297 (2006).
- Heiss, W. D., Herholz, K. Brain receptor imaging. J Nucl Med. 47 (2), 302-312 (2006).
- Brugarolas, P., Freifelder, R., Cheng, S. -. H., DeJesus, O. Synthesis of meta-substituted [18F]3-fluoro-4-aminopyridine via direct radiofluorination of pyridine N-oxides. Chemical Communications. , (2016).
- Jones, R. E., Heron, J. R., Foster, D. H., Snelgar, R. S., Mason, R. J. Effects of 4-aminopyridine in patients with multiple sclerosis. J Neurol Sci. 60 (3), 353-362 (1983).
- Davis, F. A., Stefoski, D., Rush, J. Orally administered 4-aminopyridine improves clinical signs in multiple sclerosis. Ann Neurol. 27 (2), 186-192 (1990).
- Goodman, A. D., et al. Sustained-release oral fampridine in multiple sclerosis: a randomised, double-blind, controlled trial. Lancet. 373 (9665), 732-738 (2009).
- Brugarolas, P., et al. . Abstracts Of Papers Of The American Chemical Society. , (2016).
- Brugarolas, P., et al. Development of a PET tracer for MS. J Nucl Med Meeting Abstracts. 55 (1), 1124 (2014).
- Brugarolas, P., et al. Fluorinated 4-aminopyrdines as PET tracers for MS. Journal of Nuclear Medicine. 56, 493 (2015).
- Yoswathananont, N., Nitta, K., Nishiuchi, Y., Sato, M. Continuous hydrogenation reactions in a tube reactor packed with Pd/C. Chem Comm. (1), 40-42 (2005).
- Stöcklin, G., Pike, V. W. . Radiopharmaceuticals for Positron Emission Tomography-Methodological Aspects. 24, (1993).
- Liu, Z., et al. Preclinical evaluation of a high-affinity 18F-trifluoroborate octreotate derivative for somatostatin receptor imaging. J Nucl Med. 55 (9), 1499-1505 (2014).
- Liu, Z., et al. 18F-trifluoroborate derivatives of [des-arg(10)]kallidin for imaging bradykinin b1 receptor expression with positron emission tomography. Mol Pharm. 12 (3), 974-982 (2015).
- Scott, P. J. H., Hockley, B. G., Kilbourn, M. R. . Radiochemical Syntheses, Volume 1: Radiopharmaceuticals for Positron Emission Tomography. , (2012).
Cite This Article
Brugarolas, P., Bhuiyan, M., Kucharski, A., Freifelder, R. Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases. J. Vis. Exp. (123), e55537, doi:10.3791/55537 (2017).