تحليل المناعي من الإجهاد الحبيبية تشكيل بعد تحدي البكتيريا من خلايا الثدييات
Summary
نحن تصف طريقة للتحليل النوعي والكمي لتشكيل الحبيبة الإجهاد في خلايا الثدييات بعد تحدي الخلايا مع البكتيريا وعدد من الضغوط المختلفة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول للتحقيق في الاستجابة الحبيبية الإجهاد الحبيبية في مجموعة واسعة من التفاعلات المضيف البكتيرية.
Abstract
التصوير الفلورسنت من المكونات الخلوية هو أداة فعالة للتحقيق التفاعلات المضيف الممرض. يمكن أن تؤثر العوامل المسببة للأمراض على العديد من الخصائص المختلفة للخلايا المصابة، بما في ذلك بنية الخلايا العضوية، وتنظيم الشبكة الخلوية الهيكلية، فضلا عن العمليات الخلوية مثل تشكيل الإجهاد الحبيبي (سغ). توصيف كيفية مسببات الأمراض تخريب العمليات المضيف هو جزء مهم ومتكامل من مجال التسبب. في حين أن المظاهر المتغيرة قد تكون مرئية بسهولة، والتحليل الدقيق للاختلافات النوعية والكمية في الهياكل الخلوية الناجمة عن التحدي الممرض ضروري لتحديد الاختلافات ذات دلالة إحصائية بين العينات التجريبية والسيطرة. تشكيل سغ هو استجابة الإجهاد الحفاظ على التطور الذي يؤدي إلى ردود الفعل المضادة للفيروسات، وقد تم التحقيق منذ فترة طويلة باستخدام العدوى الفيروسية 1 . كما يؤثر تشكيل سغ على شلالات التشوير وقد يكون له تأثير آخر غير معروف2 . إن توصيف هذه الاستجابة للإجهاد لمسببات الأمراض الأخرى غير الفيروسات، مثل مسببات الأمراض البكتيرية، يعد حاليا مجالا ناشئا للبحوث 3 . في الوقت الراهن، لم يتم بعد استخدام التحليل الكمي والنوعي لتشكيل سغ بشكل روتيني، حتى في النظم الفيروسية. نحن هنا وصف طريقة بسيطة لإحداث وتوصيف تكوين سغ في الخلايا غير المصابة وفي الخلايا المصابة مع الممرض البكتيري عصاري خلوي، مما يؤثر على تشكيل سغس ردا على الضغوط الخارجية المختلفة. ويتحقق تحليل تشكيل سغ وتكوينها باستخدام عدد من علامات سغ مختلفة وكاشف بقعة المكونات في من إيسي، أداة تحليل صورة مفتوحة المصدر.
Introduction
تصور التفاعلات الممرض المضيف على مستوى الخلوية هو وسيلة قوية للحصول على رؤى في الاستراتيجيات المسببة للأمراض وتحديد مسارات الخلوية الرئيسية. في الواقع، يمكن استخدام مسببات الأمراض كأدوات لتحديد الأهداف الخلوية الهامة أو الهياكل، كما تطورت مسببات الأمراض لتخريب العمليات الخلوية المركزية كاستراتيجية لبقائهم أو نشرهم. التصور من المكونات الخلوية لا يمكن أن يتحقق من خلال إعادة التعبير عن كومبوتانتلي فلورزنتلي الموسومة المضيف البروتينات. في حين أن هذا يسمح للتحليل في الوقت الحقيقي، وتوليد خطوط الخلايا مع البروتينات المضيف الموسومة على وجه التحديد هو شاقة للغاية وقد يؤدي إلى آثار جانبية غير مرغوب فيها. أكثر ملاءمة هو الكشف عن العوامل الخلوية باستخدام أجسام مضادة محددة، لأن العوامل المضيفة متعددة يمكن تحليلها في وقت واحد واحد لا يقتصر على نوع معين من الخلايا. العيب هو أنه يمكن التقاط فقط عرض ثابت كما تحليل المناعي يستلزم الخلية المضيفة فيكاتأيون. ومع ذلك، فإن ميزة هامة للتصوير المناعي هو أنه يفسح المجال بسهولة لكلا التحليل النوعي والكمي. وهذا بدوره يمكن أن تستخدم للحصول على فروق ذات دلالة إحصائية لتوفير رؤى جديدة في التفاعلات الممرض المضيف.
برامج تحليل الصور الفلورية هي أدوات تحليلية قوية لأداء تحليل 3D و 4 D. ومع ذلك، فإن ارتفاع تكلفة البرمجيات وصيانة لها جعل الأساليب على أساس البرمجيات الحرة مفتوحة المصدر أكثر جاذبية على نطاق واسع. تحليل الصور بعناية باستخدام برنامج التحليل الحيوي هو قيمة كما أنه يدعم التحليل البصري، وعند تعيين دلالات إحصائية، يزيد من الثقة في صحة النمط الظاهري معين. في السابق، تم تحليل سغس باستخدام برنامج إيماجيج مجانا، الأمر الذي يتطلب تحديد اليدوي من سغس الفردية 4 . هنا نحن نقدم بروتوكول لتحريض وتحليل تشكيل سغ الخلوية في سياق باكالالتهابات الشريانية باستخدام الحرة المصدر المفتوح برنامج تحليل الصور الحيوية إيسي (http://icy.bioimageanalysis.org). برنامج تحليل الصور الحيوية لديه برنامج الكشف عن بقعة المدمج الذي هو مناسبة للغاية لتحليل سغ. فإنه يسمح لصقل عملية الكشف الآلي في مناطق محددة من الفائدة (روي). وهذا يتغلب على الحاجة إلى التحليل اليدوي لفرادى لجان الدراسات ويزيل التحيز في أخذ العينات.
العديد من الضغوط البيئية تحفز تشكيل سغس، والتي هي مرحلة عصاري خلوي كثيفة، والهياكل غير غشائية من 0.2 – 5 ميكرون في القطر 5 ، 6 . يتم الحفاظ على هذه الاستجابة الخلوية بشكل تطوري في الخميرة والنباتات والثدييات ويحدث عندما يتم تثبيط ترجمة البروتين العالمية. أنه ينطوي على تجميع مجمعات بدء الترجمة المتوقفة في سغس، والتي تعتبر أماكن عقد ل مرناس ترانزلاتيونالي-إناكتيف، مما يتيح الترجمة الانتقائية لمجموعة فرعية من مرناس الخلوية.عند إزالة الإجهاد، سغس تذوب والأسعار العالمية لاستئصال البروتين استئناف. وتتكون سغس من عوامل بدء استطالة الترجمة والبروتينات المشاركة في استقلاب الحمض النووي الريبي، والبروتينات ملزمة رنا، وكذلك البروتينات السقالات والعوامل التي تشارك في إشارة الخلية المضيفة 2 ، على الرغم من أن التكوين الدقيق يمكن أن تختلف اعتمادا على الإجهاد المطبق. العوامل البيئية التي تحفز تشكيل سغ تشمل الجوع الحمضي الأميني، الأشعة فوق البنفسجية التشعيع، صدمة الحرارة، صدمة تناضحي، التوتر الشبكة إندوبلازميك، نقص الأكسجة والعدوى الفيروسية 2 ، 7 ، 8 . وقد تم إحراز تقدم كبير في فهم كيفية تحريض الفيروسات وتهريب أيضا تشكيل سغ، في حين لا يزال قليلا لا يزال يعرف عن كيفية مسببات الأمراض الأخرى، مثل مسببات الأمراض البكتيرية، الفطرية أو بروتوزوان، تؤثر على هذه الاستجابة الإجهاد الخلوي 1 ، 7 .
شيجيلا فليكسنيري هو سلبي غرام سلبية الممرض خلوي خلوي للبشر والعامل المسبب للإسهال الشديد أو شيجيلوسيس. ويشكل الشيغلوسيس عبئا رئيسيا على الصحة العامة ويؤدي إلى وفاة 000 28 طفل سنويا دون سن الخامسة من العمر 9 سنوات . S. فليكسنيري يصيب ظهارة القولون وينتشر خلية إلى خلية عن طريق اختراق مكونات الهيكل الخلوي المضيف 11 ، 12 . العدوى من ظهارة يدعم تكرار S. فليكسنيري داخل السيتوسول ولكن الضامة المصابة يموت من خلال عملية موت الخلايا الالتهابية يسمى بايروبتوسيس. العدوى يؤدي إلى تجنيد واسعة من العدلات والالتهاب الحاد الذي يرافقه الحرارة والإجهاد التأكسدي وتدمير الأنسجة. وهكذا، في حين أن الخلايا المصابة عرضة للضغوط الداخلية الناجمة عن العدوى، مثل اضطراب جولجي، والإجهاد السامة للخلايا وإعادة ترتيب الهيكل الخلويs، والخلايا المصابة تتعرض أيضا للضغوط البيئية بسبب العملية الالتهابية.
توصيف تأثير العدوى S. فليكسنيري على قدرة الخلايا على الاستجابة للضغوط البيئية باستخدام عدد من علامات سغ أثبتت أن العدوى يؤدي إلى الاختلافات النوعية والكمية في تكوين سغ 3 . ومع ذلك، لا يعرف سوى القليل عن مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى. نحن هنا وصف منهجية للعدوى من الخلايا المضيفة مع الممرض عصاري خلوي S. فليكسنيري ، وتشديد الخلايا مع الضغوط البيئية المختلفة، ووضع العلامات من مكونات سغ، والتحليل النوعي والكمي لتشكيل سغ وتكوينها في سياق المصابين والخلايا غير المصابة. هذا الأسلوب ينطبق على نطاق واسع لمسببات الأمراض البكتيرية الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام تحليل الصورة لتشكيل سغ للعدوى عن طريق الفيروسات أو مسببات الأمراض الأخرى. ويمكن استخدامه لتحليل سغتشكيل على العدوى أو تأثير العدوى على تشكيل سغ ردا على الضغوط الخارجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول موجزة هنا يصف تحريض، توطين، وتحليل سغس في الخلايا غير المصابة والخلايا المصابة مع الممرض عصاري خلوي S. فليكسنيري في وجود أو عدم وجود إجهاد خارجي. باستخدام برامج التصوير مجانا، والبروتوكولات يسمح للتحليل النوعي والكمي الدقيق لتشكيل سغ لتحديد وإحصائيا م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بس هو المستفيد من بيل وميليندا غيتس جراند التحدي منحة OPP1141322. وقد دعمت بف من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية في وقت مبكر زمالة بوستدوك التنقل وزميلة رو-كانتاريني ما بعد الدكتوراه. يتم دعم بس من قبل منحة همي و إرك-2013-أدغ 339579 فك.
Materials
| Primary Antibodies | |||
| eIF3b (N20), origin goat | Santa Cruz | sc-16377 | Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300 |
| eIF3b (A20), origin goat | Santa Cruz | sc-16378 | Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300 |
| eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) | Cell Signaling | 3411 | Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800 |
| eIF4AI, origin goat | Santa Cruz | sc-14211 | Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200 |
| eIF4B, origin rabbit | Abcam | ab186856 | Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300 |
| eIF4B, origin rabbit | Cell Signaling | 3592 | Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100 |
| eIF4G, origin rabbit | Santa Cruz | sc-11373 | Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300 |
| G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) | BD Biosciences | 611126 | Widely used SG marker. Dilution 1 in 300 |
| Tia-1, origin goat | Santa Cruz | sc-1751 | Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300 |
| Alexa-conjugated Secondary Antibodies | |||
| A488 anti-goat , origin donkey | Thermo Fisher | A-11055 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-goat, origin donkey | Thermo Fisher | A-11057 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
| A488 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A-21202 | Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A10037 | Dilution 1 in 500 |
| A647 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A31571 | Dilution 1 in 500 |
| A488 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A-21206 | Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A10042 | Dilution 1 in 500 |
| Other Reagents | |||
| Shigella flexneri | Available from various laboratories by request | ||
| Tryptone Casein Soya (TCS) broth | BD Biosciences | 211825 | Standard growth medium for Shigella, application – bacterial growth |
| TCS agar | BD Biosciences | 236950 | Standard growth agar for Shigella, application – bacterial growth |
| Congo red | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application – bacterial growth |
| Poly L lysine | Sigma-Aldrich | P1274 | Useful to coating bacteria to increase infection, application – infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application – infection |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application – cell culture |
| DMEM | Life Technologies | 31885 | Standard culture medium for HeLa cells, application – cell culture |
| Fetal calf serum | Biowest | S1810-100 | 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | 1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Reagent diluent, application – cell culture |
| Sodium arsenite | Sigma-Aldrich | S7400 | Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application – stress inducer |
| Clotrimazole | Sigma-Aldrich | C6019 | Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application – stress inducer |
| PFA | Electron Microscopy Scences | 15714 | 4% PFA is used for standard fixation of cells, application – fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application – permeabilization |
| A647-phalloidin | Thermo Fisher | A22287 | Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application – staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application – staining |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | BR701501 | Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application – staining |
| Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application – mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
| 24-well cell culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Standard tissue culture plates, application – cell culture |
| 12-mm glass coverslips | NeuVitro | 1001/12 | Cell culture support for immunofluorescent applications, application – cell support |
| forceps | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
| Programs and Equipment | |||
| Prism | GraphPad Software | Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application – data analysis | |
| Leica SP5 | Leica Microsystems | Confocal microsope, application – image acquisition | |
| Imaris | Bitplane | Professional image analysis program, application – data analysis | |
| Excel | Microsoft | Data analysis and graphing program, application – data analysis | |
References
- Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
- Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
- Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -. X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
- Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci. 115, 3227-3234 (2002).
- Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
- Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
- Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
- Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788 (2013).
- Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
- Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).
