Otimização e Análise Comparativa de Métodos de Enriquecimento de DNA de Plantas Organizadas Adequado para Seqüenciamento de Próxima Geração

O seqüenciamento do genoma é uma ferramenta poderosa para dissecar a base genética subjacente de traços importantes da planta. A maioria dos estudos de sequenciação do genoma se concentra no conteúdo do genoma nuclear, já que a maioria dos genes está localizada no núcleo. No entanto, os genomas organelares, incluindo as mitocôndrias (através de eucariotas) e os plastidios (nas plantas, a forma especializada, o cloroplasto, funciona na fotossíntese) contribuem com informações genéticas significativas essenciais ao desenvolvimento organizacional, à resposta ao estresse e à aptidão geral ¹ . Os genomas organelares são tipicamente incluídos em extrações de DNA total destinadas ao seqüenciamento do genoma nuclear, embora também sejam empregados métodos para reduzir o número de organelas antes da extração de DNA ² . Muitos estudos usaram resultados de seqüenciamento das extrações totais de gDNA para reunir genomas organelares ^{3 , 4 , 5 ,}xref "> ^{6, 7.} No entanto, quando o alvo do estudo é se concentrar em genomas organelares, usando o gADN total aumenta os custos de seqüenciamento porque muitas leituras são 'perdidos' para as seqüências de DNA nuclear, particularmente em plantas com grandes genomas nucleares Além disso, devido à duplicação e transferência de seqüências organelares para o genoma nuclear e entre organelas, a resolução da correta posição de mapeamento das leituras de seqüência para o genoma apropriado é um desafio bioinformático ^{2 , 8.} A purificação de genomas organelares do genoma nuclear é uma Estratégia para reduzir esses problemas. Outras estratégias de bioinformática podem ser usadas para separar as leituras desse mapa para regiões de homologia entre mitocôndrias e cloroplastos.

Enquanto os genomas organelares de muitas espécies de plantas foram sequenciados, pouco se sabe sobre a amplitude da diversidade organometrica do genomaDisponíveis em populações selvagens ou em piscinas cultivadas. Os genomas orgânicos também são conhecidos por moléculas dinâmicas que sofrem rearranjo estrutural significativo devido à recombinação entre as seqüências repetidas ⁹ . Além disso, várias cópias do genoma orgânico estão contidas dentro de cada organela e várias organelas estão contidas em cada célula. Nem todas as cópias desses genomas são idênticas, o que é conhecido como heteroplasmia. Em contraste com a imagem canônica de "círculos mestres", há agora evidências crescentes de uma imagem mais complexa das estruturas do genoma organelar, incluindo círculos sub-genômicos, cromossomos lineares, concatomas lineares e estruturas ramificadas ¹⁰ . A montagem dos genomas orgânicos de plantas é ainda mais complicada por seus tamanhos relativamente grandes e repetições substanciais inversas e diretas.

Protocolos tradicionais para isolamento organelar, purificação de DNA e genoma subseqüente A seqüenciamento é muitas vezes pesada e requer grandes volumes de entrada de tecido, com vários gramas para cima de centenas de gramas de tecido de folhas jovens necessárias como ponto de partida ^{11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17} . Isso torna o seqüenciamento genômico organelar inacessível quando o tecido é limitado. Em algumas situações, as quantidades de sementes são limitadas, como quando é necessário seqüenciar em uma base geracional ou em linhas estéreis masculinas que devem ser mantidas por cruzamento. Nessas situações, o DNA organelar pode ser purificado e depois submetido a amplificação do genoma total. No entanto, a amplificação do genoma total pode introduzir um viés de sequenciação significativo, o que é um problema particular ao avaliar variações estruturais, estruturas sub-genômicas e níveis de heteroplastia> 18. Os avanços recentes na preparação da biblioteca para tecnologias de seqüência de leitura curta superaram barreiras de baixa entrada para evitar a amplificação do genoma total. Por exemplo, o kit de preparação da biblioteca Illumina Nextera XT permite que apenas 1 ng de DNA seja usado como entrada ¹⁹ . No entanto, as preparações de bibliotecas padrão para aplicações de seqüência de leitura longa, como as tecnologias de sequenciação PacBio ou Oxford Nanopore, ainda requerem uma quantidade relativamente alta de DNA de entrada, o que pode representar um desafio para o seqüenciamento genômico organelar. Recentemente, foram desenvolvidos novos protocolos de seqüência de leitura longa, elaborados para reduzir as quantidades de insumos e ajudar a facilitar o seqüenciamento do genoma em amostras onde a obtenção de microgramas de quantidades de DNA é difícil ^{20 , 21} . No entanto, a obtenção de fracções orgânicas puras de peso molecular elevado para alimentar estas preparações de biblioteca continua a ser um desafio.

Buscamos tO comparar e otimizar métodos de enriquecimento e isolamento de DNA organelar adequados para NGS sem a necessidade de amplificação do genoma total. Especificamente, nosso objetivo era determinar as melhores práticas para enriquecer o DNA organelar de alto peso molecular de materiais de partida limitados, como uma subconjunto de uma folha. Este trabalho apresenta uma análise comparativa de métodos para enriquecer para o DNA organelar: (1) um protocolo de centrifugação diferencial modificado e tradicional versus (2) um protocolo de fracionamento de DNA com base no uso de uma abordagem comercial de DNA CpG-ligação de metilação ²² aplicado ao tecido vegetal ²³ . Recomendamos melhores práticas para o isolamento de DNA organelar a partir de tecido de folha de trigo, que pode ser facilmente estendido para outras plantas e tipos de tecido.