Ottimizzazione e analisi comparativa dei metodi di arricchimento del DNA organologico vegetale adatti per la sequenziazione di nuova generazione

Il sequenziamento del genoma è un potente strumento per disseccare la base genetica sottostante di importanti tratti vegetali. La maggior parte degli studi di sequenziamento genomico si concentra sul contenuto del genoma nucleare, in quanto la maggioranza dei geni si trova nel nucleo. Tuttavia, i genomi organellari, inclusi i mitocondri (attraverso eucarioti) e plastidi (in piante, la forma specializzata, il cloroplasto, funzionano in fotosintesi) contribuiscono a fornire notevoli informazioni genetiche fondamentali per lo sviluppo organico, la risposta allo stress e la forma ^fisica1 . I genomi organellari sono tipicamente inclusi nelle estrazioni totali del DNA destinate al sequenziamento del genoma nucleare, anche se vengono impiegati anche metodi per ridurre i numeri degli organeli prima dell'estrazione del DNA ² . Molti studi hanno utilizzato risultati di sequenziamento delle estrazioni totali di gDNA per assemblare genomi organistici ^{3 , 4 , 5 ,}xref "> ^{6, 7.} Tuttavia, quando l'obiettivo dello studio è di concentrarsi su genomi organellari, utilizzando il totale gDNA aumenta i costi di sequenziamento perché molti letture sono 'perso' per le sequenze di DNA nucleare, in particolare in impianti di grandi genomi nucleari Inoltre, a causa della duplicazione e del trasferimento di sequenze organellari nel genoma nucleare e tra gli organelli, risolvendo la corretta posizione di mappatura del sequenziamento legale al genoma corretto è bioinformatica impegnativa ^{2 , 8.} La purificazione dei genomi organellari dal genoma nucleare è una Strategia per ridurre questi problemi.Per ulteriori strategie di bioinformatics possono essere utilizzati per separare le letture che mappano alle regioni di omologia tra i mitocondri ei cloroplasti.

Mentre i genomi organellari da molte specie vegetali sono stati sequenziati, poco si sa sulla larghezza della diversità genomica organellareDisponibile in popolazioni selvatiche o in piscine coltivate. I genomi organellari sono noti anche per essere molecole dinamiche che subiscono un significativo riarrangiamento strutturale a causa della ricombinazione tra sequenze di ripetizione ⁹ . Inoltre, molte copie del genoma organellare sono contenute all'interno di ciascuna organella e sono presenti più organelli all'interno di ciascuna cellula. Non tutte le copie di questi genomi sono identiche, che è conosciuto come eteroplasma. Contrariamente all'immagine canonica di "cerchi master", ora si registra una crescente evidenza per un quadro più complesso di strutture del genoma organellare, compresi cerchi subgenomiali, cromosomi lineari, concatamers lineari e strutture ramificate ¹⁰ . L'assemblaggio di genomi organellari vegetali è ulteriormente complicato dalle loro dimensioni relativamente grandi e dalle sostanziali ripetizioni invertite e dirette.

Protocolli tradizionali per l'isolamento organellare, la purificazione del DNA e il genoma successivo I sequenziamenti sono spesso ingombranti e richiedono grandi volumi di input tissutale, con diversi grammi in aumento di centinaia di grammi di tessuti fogliari giovani necessari come punto di partenza ^{11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17} . Questo rende il sequenziamento del genoma organellare inaccessibile quando il tessuto è limitato. In alcune situazioni, gli importi dei semi sono limitati, ad esempio quando è necessario sequenziare su base generazionale o in linee sterili maschili che devono essere mantenute attraverso l'attraversamento. In queste situazioni, il DNA organellare può essere purificato e quindi sottoposto ad amplificazione del genoma intero. Tuttavia, l'amplificazione del genoma intero può introdurre significative bias di sequenziamento, che costituisce un problema particolare nella valutazione della variazione strutturale, delle strutture subgenomiche e dei livelli di eteroplasmi> 18. I recenti progressi nella preparazione della biblioteca per le tecnologie di sequenza brevettate hanno superato le barriere a basso input per evitare l'amplificazione del genoma intero. Ad esempio, il kit di preparazione alla libreria Illumina Nextera XT consente di utilizzare fino a 1 ng di DNA come input ¹⁹ . Tuttavia, le preparazioni standard di libreria per applicazioni di sequenziamento a lungo lette, come le tecnologie di sequenziamento PacBio o Oxford Nanopore, richiedono ancora una quantità relativamente elevata di DNA di input, che può rappresentare una sfida per il sequenziamento del genoma organellare. Recentemente, sono stati sviluppati nuovi protocolli di sequencing realizzati a livello manuale per ridurre gli importi e contribuire a facilitare il sequenziamento dei genomi nei campioni in cui è difficile ottenere quantità di DNA di microgrammi ^{20 , 21} . Tuttavia, ottenendo frazioni organolari puri ad alto peso molecolare per alimentare questi preparati alla libreria rimane una sfida.

Abbiamo cercato tO confrontare e ottimizzare i metodi di arricchimento e isolamento del DNA organellare adatti a NGS senza la necessità di amplificazione del genoma intero. In particolare, il nostro obiettivo era quello di determinare le migliori pratiche per arricchire il DNA organellare a peso molecolare dai materiali di partenza limitati, ad esempio un sottoinsieme di foglia. Questo lavoro presenta un'analisi comparativa dei metodi da arricchire per il DNA organellare: (1) un protocollo di centrifugazione differenziale tradizionale modificato rispetto a (2) un protocollo di frazionamento del DNA basato sull'uso di un approccio pulldown di proteine ​​del dominio di DNA di CpG ²² applicato al tessuto vegetale ²³ . Raccomandiamo le migliori pratiche per l'isolamento del DNA organellare da tessuti di foglie di grano, che possono essere facilmente estesi ad altre piante e tipi di tessuti.