Protocolos para la visualización androgénica, órganos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Se describe un protocolo para la disección, la fijación y la inmunotinción de órganos androgénica en Drosophila larvas y adultos hembras para estudiar la biosíntesis de hormonas esteroideas y su mecanismo de regulación. Además de los órganos androgénica, visualizamos la inervación de los órganos androgénica, así como células diana androgénica, tales como las células madre de línea germinal.
Abstract
En los organismos multicelulares, un pequeño grupo de células está dotado de una función especializada en su actividad biogénica, la inducción de una respuesta sistémica a crecimiento y reproducción. En los insectos, la glándula larval prothoracic (PG) y las hembras adultas de juego ovario papeles esenciales en la biosíntesis de los principales hormonas esteroides llamados ecdysteroids. Estos órganos ecdysteroidogenic están inervados desde el sistema nervioso, a través del cual la temporización de la biosíntesis se ve afectada por las señales ambientales. Aquí se describe un protocolo para la visualización de órganos ecdysteroidogenic y sus órganos interactivos en larvas y adultos de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, que proporciona un sistema modelo adecuado para el estudio de la biosíntesis de hormonas esteroideas y su mecanismo de regulación. disección hábil nos permite mantener las posiciones de los órganos ecdysteroidogenic y sus órganos interactivos, incluyendo el cerebro, el cordón nervioso ventral, y otros tejidos. La inmunotinción con unantibodies contra enzimas ecdysteroidogenic, junto con las proteínas de fluorescencia transgénicos conducidos por promotores específicos de tejido, están disponibles para marcar las células ecdysteroidogenic. Por otra parte, la inervación de los órganos ecdysteroidogenic también pueden marcarse por anticuerpos específicos o una colección de controladores de GAL4 en diversos tipos de neuronas. Por lo tanto, los órganos ecdysteroidogenic y sus conexiones neuronales pueden ser visualizadas simultáneamente por inmunotinción y técnicas transgénicas. Por último, se describe cómo visualizar las células madre de línea germinal, cuya proliferación y mantenimiento son controlados por ecdysteroids. Este método contribuye a la comprensión global de la biosíntesis de la hormona esteroide y su mecanismo de regulación neuronal.
Introduction
En los organismos multicelulares, un grupo de células está dotado de una función especializada en su actividad biogénica que es esencial para todo el cuerpo. Para cumplir su cometido, cada tejido u órgano expresa una serie de genes relacionados con sus funciones y se comunica con otros tejidos para orquestar sus actividades en el contexto del desarrollo. Para caracterizar este tipo de funciones celulares especializadas y las interacciones entre órganos, tenemos que especificar un grupo de células junto con otros tipos de células que se mantienen intactos en la arquitectura multicelular.
Un ejemplo de tales órganos especializados es un órgano steroidogenic, donde muchos enzimas biosintéticas median los pasos de conversión de colesterol a las hormonas esteroides activos 1. La mayoría de estos genes de enzimas se expresan específicamente en órganos esteroidogénicas, y la ruta de biosíntesis está estrechamente regulada por muchos estímulos externos a través de entradas humorales y entradas neuronales. Una vezsintetizados, las hormonas esteroides se secretan en la hemolinfa y se dirigen a muchos tejidos y órganos para la regulación de la expresión de una variedad de genes 2. Por lo tanto, la acción de una hormona esteroide induce una respuesta sistémica a mantener la homeostasis, el crecimiento y la reproducción.
Para investigar las funciones de la biosíntesis de la hormona esteroide y las acciones pleiotrópicos de las hormonas esteroides, Drosophila melanogaster se puede utilizar como un sistema modelo adecuado. Durante las etapas larvales, la hormona esteroide insecto, ecdiesteroide, se biosintetiza en un órgano endocrino especializada llamada la glándula prothoracic (PG) 3. En el PG, varias enzimas ecdysteroidogenic catalizan específicamente los múltiples pasos de conversión de colesterol a ecdisona, que controla la muda y la metamorfosis en las etapas de desarrollo apropiadas 4. Por lo tanto, se regula un cambio dinámico en el título de ecdiesteroidepor muchas vías de señalización en respuesta a señales ambientales. Por otra parte, en la etapa adulta, ecdiesteroide desempeña papeles esenciales en la fisiología, incluyendo la reproducción, el sueño, la memoria, y la vida útil 5, 6, 7, 8. Se sabe que ecdiesteroide se biosintetiza activamente en el ovario, la regulación de la progresión de la ovogénesis 6, 7, 8, 9, 10, 11. Recientemente hemos informado de que el número de células madre de línea germinal (GSCS) se ve afectada por la señalización de péptido ecdiesteroide y sexo en respuesta a los estímulos de acoplamiento 12.
Las potentes herramientas de D. melanogaster genética y la biología celular, incluyendo información sobre el genoma bien anotado, gen binariosistemas de expresión, y técnicas de ARNi transgénicos, nos han permitido identificar genes esenciales para la biosíntesis de ecdisteroide en el PG y el ovario 13, 14, 15. Una vez identificados los genes ecdysteroidogenic, la regulación transcripcional de estos genes y las localizaciones dinámicas de productos génicos puede ser examinado en la ruta de biosíntesis 16. Para este propósito, la transcripción-PCR cuantitativa en inversa, ARN hibridación in situ, y el análisis inmunohistoquímico se llevan a cabo. La aplicación de estas técnicas incluye una tarea difícil; la elaborada disección de la PG o el ovario. En particular, la PG de la mosca de la fruta es relativamente menor que la de otros insectos (por ejemplo, el gusano de seda y la mosca de golpe), por lo que uno tiene que practicar la habilidad vital de mosca de la fruta de disección para el muestreo. Además, ambos órganos reciben inervación ecdysteroidogenics desde el sistema nervioso central (CNS) 17, 18, 19, 20. Por lo tanto, para los análisis anatómicos precisos, los órganos ecdysteroidogenic deben mantenerse intacta junto con el sistema nervioso central y otros órganos, para no interrumpir sus conexiones neuronales.
Aquí nos proporcionan protocolos para la disección y la visualización de los órganos androgénica en D. melanogaster. El aprendizaje de la técnica de disección es el punto de partida clave para estos experimentos. Además, se puede etiquetar con éxito los órganos esteroidogénicas, así como sus órganos interactivos con varios anticuerpos y líneas Gal4 conductor. Tomando ventaja de estas técnicas, materiales, y la genética, se puede estudiar los mecanismos integrales de la biosíntesis de la hormona esteroide.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se estudió la biosíntesis ecdisteroide y su mecanismo de regulación en D. melanogaster, e ideó un protocolo para la disección y la inmunotinción. El momento de la biosíntesis de ecdiesteroide se ve afectada por las señales ambientales a través de entradas neuronales 33, por lo que es esencial para mantener la inervación de los órganos ecdysteroidogenic junto con el cerebro, VNC, y otros tejidos durante la disección.
Como se describió anteriorment…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Reiko Kise y Tomotsune Ameku por su apoyo técnico a este trabajo. Agradecemos también a Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, el Bloomington Drosophila Stock Center, Kyoto Stock Center (DGRC), y el Banco hibridoma Estudios del Desarrollo de las acciones y los reactivos. Este trabajo fue apoyado por becas a YSN de JSP KAKENHI la subvención Número 16K20945, La Fundación Naito, y el Premio de Investigación de Ciencias Inoue; y con una donación a RN de MEXT KAKENHI la subvención Número 16H04792.
Materials
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| Terumo syringe, 1ml | TERUMO | SS-01T | |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
References
- Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
- Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
- Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
- Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
- Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
- Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
- Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
- Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
- Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
- Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
- Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
- Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
- Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
- Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O’Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
- Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O’Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
- Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
- Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
- Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
- Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
- Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
- Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
- Parvy, J. -. P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
- Li, H. -. H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
- Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
- Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
- Song, X., Zhu, C. -. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
- Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
- Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
- Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
- Yamanaka, N., Marqués, G., O’Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).
