Protocoles pour Visualizing stéroïdogénique organes et leurs organes interactifs avec Immunostaining dans le Fruit Fly<em> Drosophila melanogaster</em

Dans les organismes multicellulaires, un groupe de cellules est doté d'une fonction spécialisée dans leur activité biogénique qui est essentiel pour le corps entier. Pour remplir leurs missions, chaque tissu ou organe exprime une série de gènes liés à leurs fonctions et communique avec d'autres tissus pour orchestrer leurs activités dans le cadre du développement. Pour caractériser ces fonctions cellulaires spécialisées et les interactions entre les organes, nous avons besoin de spécifier un groupe de cellules ainsi que d'autres types de cellules étant conservées intactes dans l'architecture multicellulaire.

Un exemple de ces organes spécialisés est un organe stéroïdogénique, où de nombreuses enzymes biosynthétiques les étapes de médiatisent conversion du cholestérol aux hormones stéroïdes actifs ^1. La plupart de ces gènes d'enzymes sont exprimés spécifiquement dans les organes stéroïdogenèse, et la voie de biosynthèse est étroitement régulée par de nombreux stimuli externes via des entrées humorale et entrées neuronales. Une fois quesynthétisés, les hormones stéroïdes sont sécrétés dans l'hémolymphe et sont destinés à de nombreux tissus et organes de régulation de l'expression d'une variété de gènes ^2. Par conséquent, l'action d'une hormone stéroïde induit une réponse systémique à maintenir l'homéostasie, la croissance et la reproduction.

Pour étudier les fonctions de la biosynthèse des hormones stéroïdes et les actions pléiotropiques des hormones stéroïdes, Drosophila melanogaster peut être utilisé comme système modèle approprié. Au cours des stades larvaires, dans un organe endocrine spécialisé l'hormone stéroïde insecte, ecdystéroïde, biosynthesized appelée la glande prothoracique (PG) ^3. Dans le PG, plusieurs enzymes catalysent spécifiquement ecdysteroidogenic les multiples étapes de conversion du cholestérol à l' ecdysone, qui contrôle la mue et de la métamorphose à des stades de développement appropriés ^4. Par conséquent, un changement dynamique du titre ecdystéroïde est réglementépar de nombreuses voies de signalisation en réponse aux signaux environnementaux. D'autre part, dans le stade adulte, ecdystéroïde joue un rôle essentiel dans la physiologie, y compris la reproduction, le sommeil, la mémoire et la durée de vie ^{5, 6, 7, 8.} Il est connu que ecdystéroïde est synthétisée activement dans l'ovaire, la régulation de la progression de l' ovogenèse ^{6, 7, 8, 9, 10, 11.} Récemment , nous avons rapporté que le nombre de cellules souches germinales (CSS) est affectée par ecdystéroïde et le sexe de signalisation peptidique en réponse à l' accouplement des stimuli ^12.

Des outils puissants de D. melanogaster la génétique et la biologie cellulaire, y compris l' information du génome bien annoté, gène binairesystèmes d'expression, et des techniques transgéniques ARNi, nous ont permis d'identifier des gènes essentiels à la biosynthèse ecdystéroïde dans la PG et l'ovaire ^{13, 14, 15.} Une fois que les gènes ecdysteroidogenic sont identifiés, la régulation de la transcription de ces gènes et les dynamiques de produits Localisations de gènes peuvent être examinés dans la voie de biosynthèse ^16. A cet effet, la transcription-PCR quantitative en sens inverse, l' ARN par hybridation in situ, et l' analyse immunohistologique sont effectuées. L'application de ces techniques comprend une tâche difficile; la dissection élaborée du PG ou de l'ovaire. En particulier, le PG de la mouche des fruits est relativement plus faible que celle d'autres insectes (par exemple , le ver à soie et la mouche de coup), donc on a besoin de pratiquer la compétence essentielle de la mouche des fruits dissection pour l' échantillonnage. En outre, les deux organes ecdysteroidogenic reçoivent innervations du système nerveux central (SNC) ^{17, 18, 19, 20.} Ainsi, pour les analyses anatomiques précises, les organes ecdysteroidogenic doivent être conservés intacts ainsi que le système nerveux central et d'autres organes, de ne pas perturber leurs connexions neuronales.

Ici , nous fournissons des protocoles pour la dissection et la visualisation des organes stéroïdogenèse dans D. melanogaster. L'apprentissage de la technique de dissection est la clé point de départ de ces expériences. De plus, on peut étiqueter avec succès les organes stéroïdogenèse ainsi que leurs organes interactifs avec plusieurs anticorps et des lignes de pilote GAL4. Profitant de ces techniques, les matériaux et la génétique, on peut étudier les mécanismes complets de biosynthèse des hormones stéroïdes.