Blootstelling van het varken voor CNS Histologische analyse: A Manual voor onthoofding, Schedel openen en Brain verwijdering
Summary
Het doel van dit document en instructie video te beschrijven hoe bloot en verwijder de pig postmortem hersenen en hypofyse in intacte toestand, geschikt voor daaropvolgende macroscopische en histologische analyse.
Abstract
Varkens zijn steeds populairder geworden in grote dieren translationeel neurowetenschappelijk onderzoek als een economisch en ethisch haalbaar alternatief voor niet-menselijke primaten. De grote omvang van de hersenen van het varken maakt het gebruik van conventionele klinische hersenen imagers en de directe gebruik en het testen van neurochirurgische procedures en apparatuur uit de menselijke kliniek. Verdere macroscopische en histologische analyse vereist echter postmortem blootstelling van het varken centrale zenuwstelsel (CZS) en daaropvolgende verwijdering hersenen. Dit is niet eenvoudig, aangezien de pig CNS wordt ingekapseld door een dikke, benige schedel en wervelkolom. Het doel van dit document en instructie video te beschrijven hoe bloot en verwijder de pig postmortem hersenen en de hypofyse in intacte toestand, geschikt voor daaropvolgende macroscopische en histologische analyse.
Introduction
Translationele neurowetenschappen studies in varkens hebben steeds populairder geworden in de afgelopen twee decennia. De grote omvang van de varkenshersenen maakt het gebruik van conventionele klinische hersenen beeldschermen en direct gebruik en testen van neurochirurgische procedures en apparatuur uit de menselijke kliniek 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. In de laatste 20 jaar, varkens, minivarkens bijzonder (bijvoorbeeld minipig Göttingen), zijn gebruikt om neuromodulatory behandelingsmodaliteiten, zoals stamceltransplantatie te onderzoeken; virale vector transfectie; en diepe hersenstimulatie gericht ziekte van Parkinson, obesitas, depressie en ziekte van Alzheimer 2, 6,= "xref"> 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Dit werd gevolgd door de ontwikkeling van stereotaxische chirurgische benaderingen van het CNS minipig 3, 18, 19, 20, 21 te manipuleren. De ingestelde CNS wijzigingen zijn geëvalueerd in levende dieren met behulp van brain imaging (PET 10, 13, 22, 24 en 23 MR), cystrometrie 11, 12, 25, gangbeeldanalyse17, neurologisch onderzoek 9, 17 en autopsie basis van histologie en stereologische analyse 14, 15, 17, 26, 27, 31. Echter, postmortem analyse vereist de blootstelling en verwijdering van het varken hersenen, die geen gemakkelijke taak, als dikke, benige schedel en een vezelig durale die rondom de varkenshersenen.
Het doel van dit papier en instructievideo is om te beschrijven hoe de postmortem varken hersenen en de hypofyse kunnen worden blootgesteld en afgevoerd in een intacte toestand in 15-20 min met behulp van niet-gemotoriseerde chirurgische instrumenten. De instructie video en fotografische afbeeldingen tonen mannelijke minipigs (leeftijd: 6 maanden, lichaamsgewicht: 20-25 kg) gebruikt voor een anatomische studie over de minipig hypofyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Meest experimentele neurologie studies worden uitgevoerd in kleine diersoorten, zoals muizen en ratten, waarbij toegang tot het CNS wordt vergemakkelijkt door een dunne schedel- en durale dikte. In grote proefdieren als varkens 1, 4, 8, schapen 32 en niet-humane primaten, de aanzienlijke dikte van deze structuren is het gebruik van robuuste instrumenten (tabel van materialen) en goede ingangspunten voor …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen met dankbaarheid de bekwame hulp van Mrs. Trine W. Mikkelsen, mevrouw Lise M. Fitting, en het personeel in Påskehøjgaard. De Deense Medical Research Council, de Lundbeck Foundation, en de Novo Nordisk Foundation financieel ondersteund de studie.
Materials
| Heavy Scalpel Handle #4 | FST (Fine Science Tools) | 10008-13 | Good for skin incision and soft tissue removal |
| Non-Sterile Scalpel Blades #23 | FST | 10023-00 | |
| Scalpel Handle #7 | FST | 10007-12 | Optimal for dural incision and precision work |
| Non-Sterile Scalpel Blades #11 | FST | 10011-00 | |
| Surgical Forceps | FST | 11024-18 | The tip of the surgical forceps ensure a firm grip |
| Kerrison Bone Punch | Aesculap Neurosurgery | FF713R | Must be robust, bite size 3-5 mm |
| Bone Rongeur | Aesculap Neurosurgery | MD615 | Must be robust, bite size 15 x 5 mm |
| Bone Rongeur | Aesculap Neurosurgery | FO551R | Must be robust, bite size 25 x 15 mm |
| Bone Chisel | Lawton | 67-0335 | The size of the chisel head should not exceed 20 mm |
| Mallet (Hammer) | Millarco | 5624108 | Weigth 300 g, length 30 cm, head hit area size 2 x 2 cm |
| Micro-Scissor | FST | 14002-14 | |
| Dissector | Aesculap Neurosurgery | OL165R | |
| Göttingen minipigs | Ellegaard Göttingen Minipigs A/S, Denmark | ||
| Euthanimal | pentobarbital | ||
| Ketamine | Pfizer | ||
| Midazolam | Hameln Pharmaceuticals |
References
- Lind, M. N., Moustgaard, A., Jelsing, J., Vajta, G., Cumming, P., Hansen, A. K. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neurosci Biobehav Rev. 31, 728-751 (2007).
- Bjarkam, C. R., et al. Neuromodulation in a minipig model of Parkinson disease. British J Neurosurg. 22 (Suppl. 1), S9-S12 (2008).
- Bjarkam, C. R., Cancian, G., Glud, A. N., Ettrup, K. S., Østergaard, L., Sørensen, J. C. MRI-guided stereotaxic targeting in pigs based on a stereotaxic localizer box fitted with an isocentric frame and use of SurgiPlan computer-planning software. J Neurosci Methods. 183 (2), 119-126 (2009).
- Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
- Bjarkam, C. R., et al. Safety and function of a new clinical intracerebral microinjection instrument for stem cells and therapeutics examined in the Göttingen minipig. Stereotact Funct Neurosurg. 88 (1), 56-63 (2010).
- Fjord-Larsen, L., et al. Long-term delivery of nerve growth factor by encapsulated cell biodelivery in the minipig basal forebrain. Mol Therapy. 18 (12), 2164-2172 (2010).
- Sørensen, J. C., et al. Development of neuromodulation treatments in a large animal model – Do neurosurgeons dream of electric pigs?. Prog Brain Res. 194, 97-103 (2011).
- Dolezalova, D., et al. Pig models of neurodegenerative disorders: utilization in cell replacement-based preclinical safety and efficacy studies. J Comp Neurol. 522 (12), 2784-2801 (2014).
- Mikkelsen, M., Moller, A., Jensen, L. H., Pedersen, A., Harajehi, J. B., Pakkenberg, H. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
- Danielsen, E. H., et al. The DaNEX study of embryonic mesencephalic, dopaminergic tissue grafted to a minipig model of Parkinson’s disease: Preliminary findings of effect of MPTP poisoning on striatal dopaminergic markers. Cell Transplant. 9 (2), 247-259 (2000).
- Dalmose, A., Bjarkam, C. R., Sørensen, J. C., Jørgensen, T. M., Djurhuus, J. C. Effects of high frequency deep brain stimulation on urine storage and voiding function in conscious minipigs. Neurourol Urodyn. 23 (3), 265-272 (2004).
- Dalmose, A., Bjarkam, C. R., Djurhuus, J. C. Stereotactic electrical stimulation of the pontine micturition center in the pig. Br J Urol. 95, 886-889 (2005).
- Andersen, F., Watanabe, H., Bjarkam, C. R., Danielsen, E. H., Cumming, P. Pig brain stereotaxic standard space: Mapping of cerebral blood flow normative values and effect of MPTP-lesioning. Brain Res Bull. 66 (1), 17-29 (2005).
- Glud, A. N., et al. Direct gene transfer in the minipig CNS using stereotaxic lentiviral microinjections. Acta Neurobiol Exp. 70 (3), 1-8 (2010).
- Glud, A. N., et al. Direct MRI-guided stereotaxic viral mediated gene transfer of alpha-synuclein in the minipig CNS. Acta Neurobiol Exp. 71 (4), 508-518 (2011).
- Ettrup, K. S., Sørensen, J. C., Rodell, A., Alstrup, A. K. O., Bjarkam, C. R. Hypothalamic deep brain stimulation influences autonomic and limbic circuitry involved in the regulation of aggression and cardiocerebrovascular control in the minipig. Stereotact Funct Neurosurg. 90 (5), 281-291 (2012).
- Nielsen, M. S., et al. Continuous MPTP intoxication in the minipig results in chronic parkinsonian deficits. Acta Neurobiol Exp. 76, 198-210 (2016).
- Bjarkam, C. R., et al. A MRI-compatible stereotaxic localizer box enables high-precision stereotaxic procedures in pigs. J Neurosci Methods. 139 (2), 293-298 (2004).
- Bjarkam, C. R., Jorgensen, R. L., Jensen, K. N., Sunde, N. A. A., Sørensen, J. C. H. Deep brain stimulation electrode anchoring using BioGlue®, a protective electrode covering, and a titanium microplate. J Neurosci Methods. 168, 151-155 (2008).
- Ettrup, K. S., et al. Basic Surgical Techniques in the Minipig: Intubation, Transurethral Bladder Catheterization, Femoral Vessel Catheterization, and Transcardial Perfusion. J Vis Exp. (52), e2652 (2011).
- Ettrup, K. S., Tornøe, J., Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R. A surgical device for minimally invasive implantation of experimental deep brain stimulation leads in large research animals. J Neurosci Methods. 200 (1), 41-46 (2011).
- Danielsen, E. H., et al. Positron emission tomography of living brain in minipigs and domestic pigs. Scand J Lab Anim Sci Suppl. 25 (1), 127-135 (1998).
- Røhl, L., et al. Time evolution of cerebral perfusion and ADC measured by MRI in a porcine stroke model. J Magn Reson Imaging. 15 (2), 123-129 (2002).
- Cumming, P., Gillings, N. M., Jensen, S. B., Bjarkam, C. R., Gjedde, A. Kinetics of the uptake and distribution of the dopamine D2/3 agonist (R)-N-[1-11C]n-propylnorapomorphine in brain of healthy and MPTP-poisoned Gottingen miniature pigs. Nucl Med Biol. 30 (5), 547-553 (2003).
- Jensen, K. N., Deding, D., Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R. Long-term implantation of deep brain stimulation electrodes in the pontine micturition centre of the minipig. Acta Neurochir. 151 (7), 785-794 (2009).
- Rosendal, F., et al. Does chronic low dose treatment with ciclosporin influence the brain? A histopathological study in pigs. Transplantation Proc. 37 (8), 3305-3308 (2005).
- Nielsen, M. S., Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R. The substantia nigra pars compacta of the minipig: An anatomical and stereological study. Brain Struct Funct. (4-5), 481-488 (2009).
- Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R., Simonsen, C. Z., Danielsen, E., Geneser, F. A. Oriented sectioning of irregular tissue blocks in relation to computerized scanning modalities. Results from the domestic pig brain. J Neurosci Methods. 104, 93-98 (2000).
- Bjarkam, C. R., Pedersen, M., Sørensen, J. C. New strategies for embedding, orientation and sectioning of small brain specimens enable direct correlation to MR-images, brain atlases, or use of unbiased stereology. J Neurosci Methods. 108, 153-159 (2001).
- Bjarkam, C. R., Sørensen, J. C., Geneser, F. A. Distribution and morphology of serotonin-immunoreactive axons in the hippocampal region of the New Zealand white rabbit. I. Area dentata and hippocampus proper. Hippocampus. 13 (1), 21-37 (2003).
- Bjarkam, C. R., Glud, A. N., Orlowski, D., Sørensen, J. C., Palomero-Gallagher, N. The telencephalon of the minipig, cytoarchitecture and cortical surface anatomy. Brain Struct Funct. , (2016).
- Boltze, J., Nitzsche, B., Geiger, K. D., Schoon, H. A. Histopathological investigation of different MCAO modalities and impact of autologous bone marrow mononuclear cell administration in an ovine stroke model. Transl Stroke Res. 2, 279-293 (2011).
- Jortner, B. S. The return of the dark neuron. A histological artifact complicating contemporary neurotoxicologic evaluation. Neurotoxicology. 27, 628-634 (2006).
