Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

FLAG Affinity Saflaştırma tarafından Yerli Protein Kompleksleri 1. İzolasyonu hazırlıklar Hücre peleti çözündürülmesi için bir 37 ° C su banyosu ayarlayın. 4 ° C'ye kadar bir mikro santrifüj soğutun. farklı boyutlarda çok sayıda mikro santrifüj tüpleri (1.5 mL, 15 mL) ve buz içinde bir homojenleştirici yerleştirin. liziz tamponu (50 mM Tris-HCI, pH 8, 150 mM NaCI,% 0.1 Nonidet P-40, 1 mM EDTA) içinde 10 ml hazırlamak ve buz içinde tutmak. Hemen önce tampon kullanarak, 10 1 M DTT uL EDTA içermeyen proteaz inhibitörleri ezilmiş tablet ekleyin. Antikor-bağlı taneciklerin hazırlanması NOT: antikor kaplı boncuklar önceden bir hafta kadar hazırlanmış ve gerektiği kadar buzdolabında saklanabilir. Çoğu tür daha yüksek bir afiniteye sahip olan proteini, tavşan IgG haricinde, alt tipleri immünoglobulin için Protein G, Protein A daha yüksek bir afiniteye sahiptir. 50 uL protein G-kaplı manyetik boncuklar yıkayın: Transfer 50956., bir mikrosantrifüj tüpüne boncuk çamurunun L tüp tarafında boncuk, sıvının toplanması ve çıkarmak için mıknatıs tüp yerleştirin. PBS-% 0.01 Tween-20, 0.5 ml boncuk tekrar. tüp tarafında boncuk, sıvının toplanması ve çıkarmak için mıknatıs tüp yerleştirin. PBS-% 0.01 Tween-20, 40 uL boncuk tekrar. 10 ug (1 mg, 10 uL / ​​ml stok çözelti) M2 anti FLAG antikoru ilave edin. Oda sıcaklığında 20 dakika dönme kuluçkalayın. tüp tarafında boncuk, sıvının toplanması ve çıkarmak için mıknatıs tüp yerleştirin. PBS-% 0.01 Tween-20, 0.5 mL boncuk yıkayın. tanelerine antikorun çapraz bağlama için, 0.2 M trietanolamin, pH 8.2, 1 mL ile iki kez boncuk yıkayın. Daha sonra, (kullanımdan hemen önce taze olarak hazırlanmalıdır DMP çözelti) 0.2 M trietanolamin, pH 8.2, 20 mM DMP (dimetil pimelimidat) 1 mL içinde yeniden süspanse boncuklar. 30 dakika için oda sıcaklığında dönme ile inkübe edin. </li> mıknatıs tüp yerleştirin. Süpernatantı ve 50 mM Tris-HCI pH 7.5, 0.5 mL içinde yeniden süspanse boncuklar. 15 dakika oda sıcaklığında dönme ile inkübe edin. PBS-% 0.1 Tween-20, 0.5 mL boncuk 3 kez yıkayın. ihtiyaç duyulana dek geçen yıkama boncuk bırakın. FLAG-bazlı afinite saflaştırma NOT: Uzun bir süre tampon olmadan boncuk bırakarak değil dikkatli olun. Tüm tamponlar ve tüpler her zaman buz tutulmalıdır. Aşağıdaki protokol, bir FLAG-etiketli protein 20 endojen seviyelerini sentezleyen 2-5 8 x 10 hücrelerden protein komplekslerinin saflaştırılması (10-20 mg protein lizatı) için optimize edilmiştir. Bu eriyene kadar 37 ° C'de bir su banyosu içerisinde hücre pelletini çözülme. Banyonun boruyu almak pelet tamamen eriyinceye kadar yavaşça girdap ve hemen buz üzerine, hücre süspansiyonunu içeren tüpün yerleştirin. buz sıcaklığında lizis tamponu 5 mL ekleyinHücre süspansiyonu ve girdap (DTT ve proteaz inhibitörleri içeren) karıştırın. 10 dakika boyunca buz içinde inkübe edin. Soğuk Dounce homojenizatör lizat aktarın. (Hiçbir fark edilebilir viskozite kalmayıncaya kadar) sıkı tokmak kullanılarak 20-30 vuruş ile Lyse. Soğuk mikrosantrifüj tüplerine Homojenat aktarın. 4 ° C'de 15 dakika 18,000 x g'de santrifüjleyin. Temiz soğuk tüpe temizlenir lizat aktarın. arkasında lizatının 50 mcL bırakın. Protein konsantrasyonunun ölçülmesi ve saflaşmasını izlemek için lizat 35 uL kısım alın. Tanelerden PBS-% 0.1 Tween-20 çıkarın. lizat 1 mL boncuk tekrar ve lizat kalanı ile karıştırın. 1-2 saat boyunca 4 ° C'de dönen bir çark üzerinde inkübe karışımı. mıknatıslı tüpün tarafında boncuk toplayın. süpernatan, bir 30 uL aliko toplayın ve süpernatant geri kalan atın. IPP150 tamponu (10 mM Tris-HCI pH 8, 15 0.5 mL boncuk tekrar0 mM NaCI, 1 mM EDTA,% 0.1 NP-40), 4-6 kez pipetleme. 1.5 ml soğuk tüpe aktarın. IPP150 tampon iki kez daha 0.5 mL yıkama tekrarlayın. Yıkama FLAG doğal elüsyon tamponu (20 mM Bis-Tris, pH 7, 20 mM NaCI,% 0.02 Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 200 mM ε-aminokaproik asit) 0.5 mL ile üç kez boncuklar. Son yıkamadan ile, yeni bir soğuk tüpe boncuk aktarın. İyice tamponu çıkarın. doğal elüsyon tamponu içinde 200 ug / ml 3x FLAG peptit 100 uL boncuk tekrar. yavaşça döndürülerek 10 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edilir. mıknatıslı boncuklar toplayın ve soğuk yeni bir tüpe süpernatant aktarın. Tekrarlayın iki kez 1.3.10-1.3.11 adımları tekrarlayın. Tüm taşınan ürünler Havuz. 4 ° C'de 10,000 x g'de santrifüj ile bir santrifüjlü filtre ünitesinde (10 kDa nominal moleküler ağırlık limitli kesme PES) 'de 25 uL eluatın konsantre edilir. yeni bir soğuk tüpe konsantre edildi eluatın aktarın ve% 50 glyce eklemek% 5 oranında bir nihai konsantrasyon için rolü. Gerekirse konsantre eluat, gece boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. 2. Mavi Yerli SAYFA hazırlıklar 1x doğal PAGE Anot Tamponu, 1 x doğal PAGE Lacivert Katot Tamponu ve 1 x doğal PAGE Açık Mavi Katot Tampon 1 L hazırlayın. Bir ön döküm% 3-12 doğal PAGE jel tarak çıkarın ve 1x doğal PAGE Lacivert Katot Tamponu ile kuyular iki kere yıkayın. 1x yerli SAYFA Lacivert Katot Tampon ile kuyu doldurun. koşu tankında jel kurun ama katot (iç) odacık için Lacivert Katot Tampon eklemeyin. Elektroforetik koşmak örnek hazırlayın: eluat sırasıyla nihai 1x konsantrasyonları ve% 0.005 uygun 4x doğal numune yükleme tamponunun hacmi ile% 0.5 arasında, G-250 örnek bir katkı konsantre edildi 25 uL. betwee boş kuyu ayrılan numune ve doğal moleküler ağırlık belirteçleri yükOnları nı. Tüm boş kuyu 1x doğal numune yükleme tamponunun yük 10-20 uL. örnekleri rahatsız etmemek için dikkatle 1x doğal PAGE Lacivert Katot tamponunun 200 mL 'si ile katot (iç) bölmesini doldurun. 1x doğal PAGE Anot tamponu 550 mL 'si ile anot (dış) bölmesini doldurun. 30 dakika süre ile 150 V'de jel çalıştırın. , Koşmak Dur bir serolojik pipet ile Lacivert Katot Tampon kaldırmak ve 1x Açık Mavi Katot Tampon ile değiştirin. 60 dakika boyunca koşmak devam edin. Jel C oda sıcaklığında ya da 4 ° 'de çalıştırılabilir; Sıcaklık protein kompleksi yapısı üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Jel boyama Jel kasetini açın ve kaset plakalardan birini atın. Jel, diğer kaset plakasına bağlı kalır. jel kapsayacak ve hafifçe çalkalanarak 30 dakika inkübe kadar sabitleyici çözeltisi (% 40 metanol,% 2 asetik asit) içeren bir tepsi veya kap içine jel aktarın. fiksatif solut kaldıriyon ve jel karşılamak için yeterli su ekleyin. Jel ileride kullanmak üzere taranabilir. 3. kütle spektrometri analizi Not: Numunelerin temizliğini sağlamak için mümkünse takip eden tüm aşamalar bir laminar akış içinde yapılmalıdır. Bütün çözeltiler, HPLC dereceli su ile hazırlanmalıdır. analizini gerçekleştirecektir Kütle Spektrometresi laboratuarı ile bu protokolü tartışın. hazırlıklar atıkları toplamak için başka 96-plaka üstünde konik dipli, 96 gözlü plaka koyun. Pierce, bir 21 G iğne ile konik tabanlı 96-kuyulu plakanın kuyularına alt. delikli 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına yıkayın. delikli plakanın kuyularına% 50 asetonitril-% 0.25 formik asit, 200 uL ekleyin. 10 dakika boyunca bir çalkalayıcı içinde levha istifi inkübe edin. 1 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin böylece sıvı atık toplama plakası deliklerden geçer. w atınaste sıvı. Adımları tekrarlayın 3.1.2.1-3.1.2.2 iki kere daha. 50 mM amonyum bikarbonat, 150 uL ile delinmiş 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına doldurun (taze yapılmış). Bir santrifüj filtrasyon 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına yıkayın. artığı toplamak için santrifüj filtrasyon plakasının altında, normal bir 96-çukurlu plaka koyun. santrifüj filtrasyon plakasının her oyuğuna% 50 asetonitril-% 0.25 formik asit, 200 uL ekleyin. 1 dakika için 200 x g'de levha istifini santrifüjleyin. atıkları atın. Adımları tekrarlayın 3.1.3.1-3.1.3.2 iki kere daha. Jel eksizyonu ve jel sindirim Not: jel eksize iken, tespit ve Protein standartlarının her hizalanmış jel dilimi not edin. protein standartları tüm jel dilimleri yaklaşık moleküler ağırlıkları tahmin etmek için de kullanılabilir. temiz bir yüzeye cam levha jel yerleştirin. şerit ihtiva dilimle48 özdeş dilimlere (1.5 mm x 5 mm) içine örnek ing. (Jel üstünde son beş dilim hariç) 2-3 küçük parçalar halinde, her dilim kesme ve delikli bir kuyuda her dilim ardışık olarak yerleştirin ve 96 oyuklu plaka yıkanır. Her bir oyuğa, asetonitril 50 uL ekleyin. 30-60 dakika boyunca çalkalayarak plaka inkübe edin. Adım 3.1.2.2 gibi santrifüjleme ile sıvı çıkarın. Her bir oyuğa, 50 mM amonyum bikarbonat içinde 2 mM TCEP, 200 uL ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca sallanarak inkübasyona bırakılır. Adım 3.1.2.2 gibi santrifüjleme ile sıvı çıkarın. Her bir oyuğa, 50 mM amonyum bikarbonat içinde iyodoasetamid 4 mM 200 uL ekleyin. Karanlıkta 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika çalkalanarak inkübe plakası. Adım 3.1.2.2 gibi santrifüjleme ile sıvı çıkarın. 50 mM amonyum bikarbonat, 150 uL artı asetonitril 50 uL ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çalkalama ile plaka inkübe edin. Bu yıkama adımı tekrar birtüm mavi renk jel parçalarından çıkarılır edinceye kadar birçok kez s. Saf asetonitril, 200 uL eklenerek jel parçaları kurutmak ve jel parçaları beyaz opak kadar 20 dakika oda sıcaklığında çalkalayarak inkübe edilir. asetonitril çıkarın. Her bir oyuğa, soğuk 50 mM amonyum bikarbonat içinde 0.001 mg / tripsin ml (dizileme gradlı) bir 150 uL ekleyin. 2 saat boyunca 37 ° C'de çalkalanarak inkübe plakası. 1 saat sonra, jel parçaları sıvı ile örtülü olduğunu kontrol edin; Bu durumda değilse, 50 mM amonyum bikarbonat başka 50-100 uL ekleyin. 37 ° C'de 2 saat sonra, bir gece boyunca 25 ° C'de sindirim devam edin. plakaların doğru oryantasyonunu sağlamak, jel içeren plaka altında temiz konik alt plaka yerleştirin. 1 dakika için 200 x g'de santrifüj ile peptidleri içeren sıvının toplayın. santrifüjlü bir buharlaştırıcıda peptitler içeren plaka koyun ve t yerine getirirken sıvının buharlaştırılmasıBir sonraki adımda,. Jel parçaları,% 50 asetonitril-% 0.25 formik asit, 150 uL ekleyin. 30 dakika boyunca 37 ° C'de çalkalayarak kuluçkalayın. 1 dakika için 200 x g'de santrifüj ile adım 3.2.9 kısmen kurutulmuş plaka içine sıvı toplamak. Bir sonraki adım yerine getirirken peptitler içeren plaka buharlaştırılması devam edin. Tekrarlayın 3.2.10-3.2.11 adımları tekrarlayın. Jel parçaları içeren bir plakanın her bir oyuğuna, saf asetonitril 200 uL ekleyin. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalayarak kuluçkalayın. 1 dakika için 200 x g'de santrifüj ile peptitler içeren plaka sıvı toplamak. tüm oyuklarda asetonitril nihai konsantrasyon% 55 üzerinde olduğundan emin olun. Gerekirse, ekstra saf asetonitril ekleyin. yıkandı, santrifüj, filtrasyon plağına peptit solüsyonları aktarın. peptidleri toplamak için bunun altında temiz bir konik alt plaka koyun. 1 dakika için 200 x g'de levha istifini santrifüjleyin. evaporçukurlar tamamen kuru hale gelene kadar konik alt plaka içindeki sıvıyı yedi. plaka bir silikon kapak ile kapatıldı ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir. kuvvetle 15 dakika boyunca çalkalama ile% 0.5 formik asit 32 uL peptidler yeniden çözülür. 400 mM amonyum bikarbonat 8 uL eklenir ve güçlü bir 15 dakika boyunca çalkalayarak inkübe edin. 1 dakika için 200 x g'de plaka santrifüjleyin. bir silikon kapak ile kapatılır ve kütle spektrometrisi analize kadar -20 ° C 'de plaka saklayın. Kütle spektrometrisi NOT: av tüfeği proteomik uyumlu yöntemler kullanılarak yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi üzerinde peptidleri analiz edin. Veri bağımlı alıcı Bu tür bir analiz için en yaygın olarak kullanılan MS kurulumu LC-tandem ve arka plan gürültü üzerine gereksiz sıralama ve aday seçimi en aza indirerek, etkili peptit tanımlama için optimize edilmelidir. Birinci aşama kütle analizi tarama (MS1) kütle spektrumları, profil modunda kaydedilmelidir. Bu tavsiye olduğunued, tercihen ikinci aşamada kütle analizi (MS2) için iki kat ve üç kat yüklü iyonlar seçmek için kullanılır. , m / z 400-1,600 arasında bir kütle aralığı 8-30 amino asit aralığında en peptidleri belirlemek için uygundur. Burada bir Orbitrap kütle spektrometresi kullanılarak analiz için bir protokol sağlanır. Bir nanoLC-MS / MS sistemi otomatik örnekleyici kullanılarak analiz başına 20 ul numune enjekte edilir. C18 kolonu (100 mm id, 2 cm) tuzunun giderilmesi ve bir ters faz üzerinde peptitler konsantre edilir. 300 nL / dak 4-28% asetonitril /% 0.1 formik asit 30 dakikalık bir doğrusal eğimi kullanılarak bir analitik C18 kolonu (75 um id, 15 cm) üzerinde ayrı peptidler. Aşağıdaki parametreler ile bir üst 10 veri bağımlı etme yöntemi ile bir kütle spektrometresinde peptidleri analiz: m / z aralığı 380-1,600, m çözünürlüğü 30.000 / z 400, 2 Th izolasyonu genişliği, 45 sn için ± 10 ppm dinamik dışlama otomatik kazanç kontrol hedef MS / MS, maksimum enjeksiyon süresi 1 x MS 10 6 ve 5.000 MS 150 msMS / MS 100 ms. 4. Veri Analizi MaxQuant kullanılarak protein tanımlanması ve miktar tayini kütle spektrometrisi ham verilerden her jel fraksiyonu içinde proteinlerin belirlenmesi ve ölçmek için serbestçe MaxQuant yazılımını kullanın. NOT: MaxQuant veri bağımlı edinim av tüfeği proteomik yaklaşımlar tarafından oluşturulan verileri üzerinde çalışır. Mavi doğal jel fraksiyonlardan MS verileri ayrı deneylerde olarak ve tüm jel dilimleri birleştiren bir deney parçaları olarak toplu analiz edilmelidir. stokiyometri hesaplamaları gerçekleştirmek için iBAQ değer kutusunu işaretleyin. MaxQuant kullanılarak veritabanı arama ve protein miktarının belirlenmesi için ayrıntılı protokolleri, 22, 21 olarak tarif edilmektedir. Perseus kullanarak protein profili analizi tespit proteinlerin göç profillerini görüntülemek için serbestçe kullanılabilir yazılım Perseus kullanın ve kullanarak bunları karşılaştırmakistatistiksel analiz. NOT: Perseus nasıl kullanılacağı konusunda genel belgeler http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorials mevcuttur. Bir numune kümesi ek veri olarak kullanılabilir. Tüm jel fraksiyonları için protein tanımlamaları ve miktar değerleri içeren MaxQuant analizi ile döndürülen proteingroups.txt dosyası yükleyin. Ana kutusu (Şekil 1) yoluyla yoğunluk değerlerini doldurmak. Bir matris sütunlar gibi jel fraksiyonları ile, satır bütün protein tanımlamaları içeren görünür. Hit tersine karşılık gelen girişleri, sadece filtre satırları açılır menü kategorik sütun göre filtre satır (Şekil 2) seçerek ve olası kirletici tarafından tanımlanan proteinler çıkarın. Daha sonra, normalize açılır menüden Sum (Şekil 3) Divide seçerek toplam protein yoğunluğunda karşı profili boyunca, her bir protein fraksiyonu yoğunlukları normalize. Yeni matrix görünür. Görselleştirme açılır menüsünden (Şekil 4) içinde Profil Plot seçerek tüm proteinlerin göç profili araziler görüntüler. Filtre satırlar açılır menüden geçerli değerlere dayalı Seç Filtre satırları. Gerekli geçerli değerlerin sayısında 1 girin. Kümelenme / PCA açılır menüden Hiyerarşik kümeleme seçerek tüm mavi yerli jel fraksiyonları arasında belirlenen proteinlerin hiyerarşik kümeleme gerçekleştirin. Sütunlar ağaç kutusu (Şekil 5) kaldırınız. Kesecikleri daha sonra matris (Şekil 6) için Kümelenme sekmede ısı harita içinde görülür. dendrogram içinde yem protein içeren küme bulun. kümenin diğer parçaları yem ile birlikte göç proteinleri temsil ve bu nedenle aynı kompleksinin potansiyel etkileşim proteinleri / alt birimi vardır. <b r /> Şekil Kahraman veri yükleme penceresinin 1. ekran görüntüsü. Şekil Perseus'a; proteinin belirlenmesi ve ölçümü veri yüklenmesi için adımları göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. Site tarafından tanımlanan hit ve proteinleri, ters kirleticilere karşı gelen girdileri filtreleme için Kahraman penceresinin 2. ekran görüntüsü Şekil. kategorik sütuna göre filtreleme satırları seçme protein girdi türleri seçmek için yeni bir pencere veri setinden elimine edilmesi açılır. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. /55498fig3.jpg"/> Kahraman normalleştirme penceresinin 3. ekran görüntüsü Şekil. Normalleştirme menüsündeki Divide seçilmesi farklı seçeneklerle yeni bir pencere açar. Sum seçilmesi, tüm fraksiyonlar arasında bu proteinin toplam yoğunluğu her fraksiyonda bir proteinin yoğunluk değeri böler. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. Perseus göç profili araziler gösteren Şekil 4. ekran görüntüsü. Proteinler, karşılık gelen profil seçmek için profil aşağıdaki matris içinde seçilebilir. Araç çubuğu profillerini düzenleyebilir ve ihracat için kullanılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. <p class="jove_content" fo:keep-together.within sayfalık = "always"> Perseus hiyerarşik kümeleme penceresinin 5. ekran görüntüsü Şekil. Şekil Manhattan (L1) mesafe metriği ile proteinlerin hiyerarşik kümelenme için ayarları gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. Perseus'a Şekil 6. Ekran dendrogramını ve protein yoğunlukları ısı haritası yok. Ana panelin sağ taraftaki akışı yapılan her adım ve elde edilen matris gösterir ve herhangi bir adım geri kullanılabilir. iş akışı, aynı zamanda, herhangi bir ara matrisinden dallan. Bu f daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınŞEKIL. göreceli stokiyometri hesaplanması yem protein ile birlikte kümelenme göre bir protein kompleksinin alt-birimleri seçip göründükleri profili tepe noktası (ler) sınırlandırır. Her bir fraksiyonun her bir alt ünitesi için MaxQuant analizi ile döndürülen iBAQ değerleri ayrı ayrı kullanımı ve bu fraksiyon karşılık gelen yem iBAQ değerine göre normalize edilecektir. Seçilen tepe fraksiyonları arasında yem ve protein kompleksi alt birimleri için normalize iBAQs Konu ve lineer regresyon uygulanmaktadır. Onların normalize iBAQ değerlerinin eğilimleri karşılaştırarak yem karmaşık alt biriminin nispi miktarını hesaplayın. protein kompleksi büyüklük değerlendirme Örnek Lane hizalama mavi doğal jel dilimleri için tahmin edilen molekül ağırlıklarını hesaplamak için protein standartlarını kullanarak. Bunlardan, y ekseni jel x ekseni dilimleri ve moleküler ağırlıkları çizilerek doğrusal bir regresyon modeli oluşturur. </li> bunların tanımlandığı mavi doğal dilim (ler) e göre protein kompleksi (ler) in gözlemlenen moleküler ağırlık aralığı tahmin etmek için modeli kullanın.