Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

1. Isolamento di complessi proteici nativi da FLAG Affinity Purification preparativi Impostare un bagno di acqua 37 ° C per scongelare il pellet. Raffreddare una microcentrifuga a 4 ° C. Posizionare diversi tubi microcentrifuga di diverse dimensioni (1,5 ml, 15 ml) ed un omogeneizzatore nel ghiaccio. Preparare 10 mL di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA) e mantenere in ghiaccio. Appena prima di utilizzare il tampone, aggiungere 10 ml di 1 M DTT e una tavoletta schiacciata di inibitori della proteasi privo di EDTA. Preparazione di perline anticorpo-linked NOTA: Le perle legate agli anticorpi possono essere preparati fino a una settimana in anticipo e conservati in frigorifero fino al momento. Proteina G ha un'affinità superiore proteina A per la maggior parte delle specie immunoglobuline sottotipi, tranne per le IgG di coniglio, per il quale la proteina A ha una maggiore affinità. Lavare 50 ml di sfere magnetiche proteina G-rivestiti: Trasferimento 50 &# 956; L del cordone di sospensione in una provetta, posizionare il tubo nel magnete per raccogliere le perline sul lato del tubo e rimuovere il liquido. Risospendere le sfere in 0,5 mL di PBS-0,01% Tween-20. Porre il tubo nel magnete per raccogliere le perline sul lato del tubo e rimuovere il liquido. Risospendere le sfere in 40 microlitri di PBS-0,01% Tween-20. Aggiungere 10 mg (10 ml di 1 mg / ml soluzione madre) di M2 anticorpo anti-FLAG. Incubare con rotazione per 20 minuti a temperatura ambiente. Porre il tubo nel magnete per raccogliere le perline sul lato del tubo e rimuovere il liquido. Lavare le perline con 0,5 mL di PBS-0,01% Tween-20. Per reticolazione l'anticorpo ai talloni, lavare le perle due volte con 1 ml di 0,2 M pH 8,2 trietanolammina. Poi, risospendere le sfere in 1 ml di 20 mM DMP (dimetil pimelimidate) in 0,2 M trietanolammina pH 8,2 (soluzione DMP deve essere preparato fresco immediatamente prima dell'uso). Incubare con rotazione a temperatura ambiente per 30 min. </li> Posizionare il tubo nel magnete. Rimuovere il surnatante e risospendere le sfere in 0,5 ml di 50 mM Tris-HCl pH 7,5. Incubare con rotazione a temperatura ambiente per 15 min. Lavare le perline 3 volte con 0,5 mL di PBS-0.1% Tween-20. Lasciare perline in ultimo lavaggio fino a quando necessario. purificazione per affinità FLAG-based NOTA: Fare attenzione a non lasciare le perline, senza buffer per un lungo periodo di tempo. Tutti i tamponi e tubi dovrebbero essere tenuti in ghiaccio in ogni momento. Il seguente protocollo è ottimizzato per la purificazione di complessi proteici di 2-5 x 10 8 cellule (10-20 mg proteina lisato) esprimono livelli endogeni di una proteina FLAG-tag 20. Scongelare il pellet di cellule in un bagno d'acqua a 37 ° C fino a quando non inizia a sciogliersi. Prendere il tubo dal bagno, roteare delicatamente fino il pellet è completamente scongelato, e collocare immediatamente il tubo contenente la sospensione cellulare su ghiaccio. Aggiungere 5 ml di tampone di lisi ghiacciato(Contenente DTT e inibitori di proteasi) alla sospensione cellulare e agitare per mescolare. Incubare in ghiaccio per 10 min. Trasferire il lisato ad un omogeneizzatore Dounce freddo. Lisare con 20-30 colpi utilizzando il pestello stretto (fino a quando nessun viscosità evidente). Trasferire l'omogeneizzato ai tubi microcentrifuga freddi. Centrifugare a 18.000 xg per 15 min a 4 ° C. Trasferire il lisato eliminato in una provetta pulita fredda. Lasciare 50 ml di lisato dietro. Prendete un'aliquota 35 microlitri di lisato per misurare la concentrazione di proteine ​​e monitorare la purificazione. Rimuovere il PBS-0.1% Tween-20 dalle perline. Risospendere le sfere con 1 ml di lisato e mescolare con il resto del lisato. Incubare la miscela in una ruota girevole a 4 ° C per 1-2 h. Raccogliere le perline sul lato del tubo con il magnete. Raccogliere un'aliquota di 30 ml di surnatante e scartare il resto del surnatante. Risospendere le sfere in 0,5 mL di tampone IPP150 (10 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% NP-40) pipettando 4-6 volte. Trasferire in una provetta da 1,5 ml a freddo. Ripetere i lavaggi con 0,5 mL di tampone IPP150 altre due volte. Lavaggio Perle tre volte con 0,5 mL di tampone di eluizione FLAG nativo (20 mM Bis-Tris pH 7, 20 mM NaCl, 0,02% Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 200 mM acido ε-amminocapronico). Con l'ultimo lavaggio, trasferire le perle in una nuova provetta freddo. Rimuovere completamente tampone. Risospendere le sfere in 100 ml di 200 mg / ml 3x FLAG peptide in tampone di eluizione nativo. Incubare a 4 ° C per 10 min con rotazione dolce. Raccogliere le perline con il magnete e trasferire il surnatante in una nuova provetta freddo. Ripetere i passaggi 1.3.10-1.3.11 due volte. Piscina tutto gli eluati. Concentrare l'eluato fino a 25 microlitri in un'unità filtro centrifugo (10 kDa nominale limite di peso molecolare cut-off, PES) tramite centrifugazione a 10.000 xg a 4 ° C. Trasferire l'eluato concentrato in una nuova provetta fredda e aggiungere il 50% glycerol per una concentrazione finale del 5%. L'eluato concentrato può essere conservato a 4 ° C per una notte, se necessario. 2. Blu Native PAGE preparativi Preparare 1 l di 1x PAGE nativo anodo Buffer, 1x PAGE nativo blu scuro catodo Buffer e 1x PAGE nativo Light Blue catodo Buffer. Rimuovere il pettine di un gel PAGE nativo prefabbricati 3-12% e lavare i pozzetti due volte con 1x PAGE nativo blu scuro catodo Buffer. Riempire i pozzetti con 1x PAGE nativo blu scuro catodo Buffer. Impostare il gel nel serbatoio in esecuzione ma non aggiungere Dark Blue catodo Buffer al catodo (interno) della camera. corsa elettroforetica Preparare il campione: Per i 25 microlitri concentrati eluato aggiungere volume appropriato di 4x tampone campione carico nativo e del 0,5% G-250 additivo campione per concentrazioni finali di 1x e 0,005% rispettivamente. Caricare il campione e marcatori di peso molecolare native lasciando un pozzo vuoto betweeli, n. Carico 10-20 ml di 1x campione nativo tampone di caricamento in tutti i pozzetti vuoti. Riempire la (interno) camera di catodo con 200 ml di 1x PAGE nativo blu scuro Cathode Buffer con attenzione in modo da non disturbare i campioni. Riempire la camera di anodo (esterno) con 550 ml di 1x PAGE nativo anodo Buffer. Eseguire il gel a 150 V per 30 minuti. Fermare la corsa, rimuovere il blu scuro catodo Buffer con una pipetta sierologica e sostituirlo con 1x Light Blue catodo Buffer. Continuare la corsa per 60 min. Il gel può essere effettuata a temperatura ambiente oa 4 ° C; la temperatura potrebbe avere un effetto sulla proteina struttura complessa. Gel colorazione Aprire la cassetta gel e scartare una delle piastre cassette. Il gel rimane attaccato all'altra piastra cassetta. Trasferire il gel in un vassoio o recipiente contenente la soluzione sufficiente fissativo (40% metanolo, 2% di acido acetico) per coprire il gel e incubare per 30 min agitando delicatamente. Rimuovere la solut fissativoioni e aggiungere acqua sufficiente a coprire il gel. Il gel può essere sottoposto a scansione per riferimento futuro. Analisi 3. Spettrometria di Massa Nota: Tutti i passaggi successivi devono essere eseguite in una cappa a flusso laminare, se possibile, per garantire la pulizia dei campioni. Tutte le soluzioni devono essere preparate con acqua HPLC-grade. Discuti questo protocollo con il laboratorio di spettrometria di massa che effettuerà le analisi. preparativi Posizionare una piastra a 96 pozzetti a fondo conico su un'altra piastra a 96 pozzetti per la raccolta dei rifiuti. Pierce fondo dei pozzetti della parte inferiore 96 pozzetti conica con un ago 21 G. Lavare i pozzetti della piastra forata 96 pozzetti. Aggiungere 200 microlitri di 50% acido formico acetonitrile-0,25% ai pozzetti della piastra forata. Incubare la pila di piastre in un agitatore per 10 min. Centrifugare a 500 xg per 1 min in modo che il liquido fluisce attraverso i fori nella piastra di raccolta rifiuti. Eliminare il waste liquido. Ripetere i passaggi 3.1.2.1-3.1.2.2 altre due volte. Riempire i pozzetti della piastra forata 96 pozzetti con 150 ml di 50 mM di bicarbonato di ammonio (fresco). Lavare i pozzetti di una filtrazione centrifuga piastra a 96 pozzetti. Posizionare una normale piastra a 96 pozzetti sotto la piastra di filtrazione centrifuga per raccogliere i rifiuti. Aggiungere 200 microlitri di 50% acido formico acetonitrile-0,25% a ciascun pozzetto della piastra di filtrazione centrifuga. Centrifugare la pila di piastre a 200 xg per 1 min. Smaltire i rifiuti. Ripetere i passaggi 3.1.3.1-3.1.3.2 altre due volte. Gel escissione in gel digestione NOTA: Mentre ablazione del gel, identificare e prendere nota della fetta gel allineato a ciascuna delle norme proteine. Gli standard di proteine ​​possono essere usate per stimare pesi molecolari approssimative per tutte le sezioni di gel. Porre il gel con la lastra di vetro su una superficie pulita. Tagliate la corsia contieneing campione in 48 fette identiche (1,5 mm x 5 mm). Tagliare ogni fetta in 2-3 pezzi più piccoli (ad eccezione degli ultimi cinque fette nella parte superiore del gel) e porre ogni fetta in sequenza in un pozzetto della forato e lavato piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 50 ml di acetonitrile a ciascun pozzetto. Incubare la piastra con agitazione per 30-60 min. Rimuovere il liquido mediante centrifugazione come al punto 3.1.2.2. Aggiungere 200 ml di 2 mM TCEP in 50 mM di bicarbonato di ammonio a ciascun pozzetto. Incubare la piastra con agitazione per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il liquido mediante centrifugazione come al punto 3.1.2.2. Aggiungere 200 ml di 4 mM iodoacetammide in 50 mM di bicarbonato di ammonio a ciascun pozzetto. Incubare la piastra con agitazione per 30 minuti a 37 ° C al buio. Rimuovere il liquido mediante centrifugazione come al punto 3.1.2.2. Aggiungere 150 ml di 50 mM di bicarbonato di ammonio più 50 ml di acetonitrile e incubare la piastra con agitazione per 30 minuti a temperatura ambiente. Ripetere questo lavaggio passaggio di uns numero di volte necessario fino a quando tutto il colore blu è rimossa dai pezzi di gel. Disidratare i pezzi di gel aggiungendo 200 ml di acetonitrile puro e incubare con agitazione a temperatura ambiente per 20 min finché i pezzi di gel sono bianche ed opache. Rimuovere acetonitrile. Aggiungere 150 ml di 0,001 mg / ml di tripsina (sequenziamento grado) in freddo 50 mM di bicarbonato di ammonio a ciascun pozzetto. Incubare la piastra con agitazione a 37 ° C per 2 h. Dopo 1 h, controllare che i pezzi di gel sono coperti di liquido; se questo non è il caso, aggiungere un'altra 50-100 ml di 50 mM di bicarbonato di ammonio. Dopo 2 ore a 37 ° C, proseguire la digestione a 25 ° C per una notte. Posizionare una piastra di fondo conico pulito sotto la piastra di gel contenente, garantendo il corretto orientamento delle piastre. Raccogliere il liquido contenente i peptidi mediante centrifugazione a 200 xg per 1 min. Posizionare la piastra peptidi contenenti in un evaporatore centrifugo ed evaporare il liquido durante lo svolgimento tegli passo successivo. Aggiungere 150 microlitri di 50% acido formico acetonitrile-0,25% per i pezzi di gel. Incubare con agitazione a 37 ° C per 30 min. Raccogliere il liquido nella piastra parzialmente essiccato dal punto 3.2.9 mediante centrifugazione a 200 xg per 1 min. Continuare evaporazione del piatto peptidi contenenti nell'eseguire il passaggio successivo. Ripetere i passaggi 3.2.10-3.2.11. Aggiungere 200 ml di acetonitrile puro a ciascun pozzetto della piastra contenente i pezzi di gel. Incubare con agitazione a temperatura ambiente per 15 min. Raccogliere il liquido nella piastra contenente peptidi mediante centrifugazione a 200 xg per 1 min. Assicurarsi che la concentrazione finale di acetonitrile in tutti i pozzetti è superiore al 55%. Se necessario, aggiungere acetonitrile purissimo. Trasferire le soluzioni peptide alla piastra di filtrazione centrifuga lavato. Posizionare un piatto fondo conico pulita sotto di esso per raccogliere i peptidi. Centrifugare la pila di piastre a 200 xg per 1 min. Evapormangiato il liquido nella piastra di fondo conico fino pozzetti siano completamente asciutte. La piastra può essere coperto con un coperchio silicone e conservato a -20 ° C in questa fase. Ridisciogliere peptidi in 32 ml di acido formico 0,5% con vigorosa agitazione per 15 min. Aggiungere 8 ml di 400 mM di bicarbonato di ammonio e incubare con vigorosa agitazione per 15 min. Centrifugare la piastra a 200 xg per 1 min. Coprire con un coperchio di silicone e conservare la piastra a -20 ° C fino all'analisi di spettrometria di massa. Spettrometria di massa NOTA: Analizzare i peptidi su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione con metodi compatibili con la proteomica fucile da caccia. Acquisizione dati dipendente è la LC-tandem più comunemente usato MS predisposta per questo tipo di analisi e dovrebbe essere ottimizzato per l'identificazione efficiente peptide, minimizzando sequenziamento ridondante e selezione dei candidati su rumore di fondo. spettri di massa nell'analisi scansione prima massa stadio (MS1) va registrato in modalità profilo. Si raccomandaed per selezionare preferenzialmente ioni doppiamente e triplamente praticati per la seconda fase di analisi di massa (MS2). Una gamma di massa m / z 400-1,600 atto ad identificare la maggior parte dei peptidi tra 8-30 gamma aminoacidi. Qui, è previsto un protocollo per analisi utilizzando uno spettrometro di massa Orbitrap. Iniettare 20 ml di campione per l'analisi utilizzando l'auto-campionatore di un sistema di nanoLC-MS / MS. Desalificare e concentrare peptidi su una colonna in fase inversa C18 (100 um id, 2 cm). peptidi separati su una colonna analitica C18 (75 um id, 15 cm) usando un gradiente lineare 30 min di 4-28% acido formico acetonitrile / 0,1% a 300 Nl / min. Analizzare peptidi in uno spettrometro di massa con una parte superiore metodo di acquisizione dati dipendenti 10 con i seguenti parametri: m / z gamma 380-1,600, risoluzione 30.000 a m / z 400, larghezza di isolamento 2 Th, esclusione dinamica a ± 10 ppm per 45 s , desiderato di controllo automatico del guadagno a 1 x 10 6 per MS e 5.000 per MS / MS, tempo massimo di iniezione 150 ms per MS e100 ms per MS / MS. Analisi 4. I dati l'identificazione delle proteine ​​e la quantificazione usando MaxQuant Utilizzare il software MaxQuant liberamente disponibili per identificare e quantificare le proteine ​​in ogni frazione di gel dai dati grezzi spettrometria di massa. NOTA: MaxQuant lavora su dati generati dall'acquisizione shotgun proteomica approcci dipendenti dai dati. I dati MS delle frazioni blu gel nativi devono essere analizzati in batch esperimenti separati e non come frazioni di un esperimento che unisce tutte le fette di gel. Selezionare la casella valore iBAQ per eseguire calcoli stechiometria. Protocolli dettagliati per la ricerca di database e proteine quantificazione usando MaxQuant sono descritti in 21, 22. Analisi profilo proteico utilizzando Perseo Utilizzare il software liberamente disponibile Perseus per visualizzare i profili di migrazione delle proteine ​​identificate e confrontarli conanalisi statistica. NOTA: la documentazione generale su come utilizzare Perseo è disponibile presso http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorials. Un set di dati campione è disponibile come dati supplementari. Carica il file proteingroups.txt restituito dal analisi MaxQuant contenente le identificazioni di proteine ​​e valori di quantificazione per tutte le frazioni di gel. Inserire i valori di intensità in area principale (Figura 1). Apparirà una matrice contenente tutte le identificazioni proteiche in fila, con le frazioni gel come colonne. Rimuovere voci corrispondenti ai risultati inversa, solo proteine identificate dal sito e potenziali contaminanti selezionando righe filtro basato su colonna categorica nel menu a discesa Filtro righe (Figura 2). Normalizzare le intensità frazione di ciascuna proteina di tutti i profilo contro l'intensità totale proteina selezionando Divide nel menu a discesa Normalizzazione, quindi Sum (Figura 3). Un nuovo mappare Atrix. Visualizzare i grafici di profilo migrazione di tutte le proteine selezionando trama profilo nel menu a discesa visualizzazione (Figura 4). Selezionare Filtro righe in base a valori validi nel menu a discesa Filtrare le righe. Immettere 1 nel numero di valori validi richiesti. Eseguire il clustering gerarchico delle proteine ​​identificate in tutte le frazioni blu gel nativi selezionando clustering gerarchico nel menu a discesa Clustering / PCA. Deselezionare la casella Colonne albero (Figura 5). I cluster sono visualizzate in una mappa termica nella scheda Clustering accanto alla matrice (Figura 6). Individuare il cluster contenente la proteina esca in dendrogramma. Altri componenti del cluster rappresentano proteine ​​co-migrazione con l'esca e sono quindi potenziali proteine ​​interagenti / subunità del complesso stesso. <b r /> Figura 1. schermo di finestra di caricamento dati Perseo. La figura mostra i passaggi per il caricamento di identificazione delle proteine ​​e dei dati quantificazione in Perseus. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2. Schermata della finestra Perseus per il filtraggio di voci corrispondenti ai contaminanti, colpi e proteine identificate dal sito inversa. Selezionando Filtro righe per colonna categorica apre una nuova finestra di selezione dei tipi di voci proteine ​​da eliminare dal set di dati. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. /55498fig3.jpg"/> Figura 3. Cattura schermo di finestra normalizzazione Perseo. Selezione Divide nel menu Normalizzazione apre una nuova finestra, con diverse opzioni. Selezionando Somma divide il valore di intensità di una proteina in ogni frazione per l'intensità totale di proteine ​​che in tutte le frazioni. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4. Cattura schermo di Perseus mostra grafici di profilo migrazione. Le proteine ​​possono essere selezionate nella matrice sotto i profili per evidenziare la loro profilo corrispondente. La barra degli strumenti può essere utilizzato per modificare ed esportare i profili. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "always"> Figura 5. Schermata della finestra clustering gerarchico Perseo. La figura mostra le impostazioni per il clustering gerarchico di proteine ​​usando Manhattan (L1) distanza metrica. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 6. Figura di Perseo che mostra dendrogram e intensità proteine heatmap. Il flusso di lavoro sul lato destro del pannello principale mostra ogni passo intrapreso e la matrice risultante, e può essere usato per annullare qualsiasi passaggio. Il flusso di lavoro può anche diramano da qualsiasi matrice intermedia. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questo fIGURA. Calcolo di relativa stechiometria Selezionare le subunità di un complesso proteico in base alla loro co-raggruppamento con la proteina esca e delimitare il picco profilo (s) dove compaiono. Utilizzare i valori restituiti iBAQ mediante analisi MaxQuant per ciascuna subunità in ciascuna frazione separatamente e normalizzare dal corrispondente valore iBAQ esca in quella frazione. Tracciare i iBAQs normalizzati esca e proteine ​​subunità complesse attraverso le frazioni del picco selezionato e applicare regressione lineare. Calcolare quantità relativa di subunità complesso di esca confrontando le tendenze dei loro valori iBAQ normalizzati. Stima di proteine ​​dimensione complessa Utilizzare gli standard di proteine ​​per calcolare pesi molecolari previsti per le allineamento blu fette di gel nativi dalla corsia del campione. Da questi, generare un modello di regressione lineare tracciando fette di gel in asse x e pesi molecolari in asse y. </li> Utilizzare il modello per stimare la gamma osservata peso molecolare del complesso proteico (es) basato sulla fetta nativo blu (s) da cui sono stati identificati.