Регистрация цельноклеточных патч-фиксаторов для электрофизиологического определения селективности ионов в канале-каналодопсинах
Summary
This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.
Abstract
За последнее десятилетие каналодродоксины стали незаменимыми в неврологических исследованиях, где они используются как инструменты для неинвазивного манипулирования электрическими процессами в клетках-мишенях. В этом контексте особенно важна ионная селективность канала -родопсина. В данной статье описывается исследование селективности хлоридов для недавно идентифицированного анион-проводящего канала -родопсина Proteomonas sulcata посредством электрофизиологических записей патч-струбцины на клетках HEK293. Экспериментальная методика измерения светоизлучающих фототоков требует быстро переключаемого – идеально монохроматического – источника света, подключенного к микроскопу обычной установки патч-струбцины. Подготовительные процедуры перед экспериментом описаны с подготовкой буферных растворов, соображениями о потенциалах жидкого соединения, посевом и трансфекцией клеток и вытягиванием пипетки. Фактическая запись отношения напряжение-напряжениеС для определения обратимых потенциалов для различных концентраций хлоридов происходит через 24 ч до 48 ч после трансфекции. Наконец, электрофизиологические данные анализируются по теоретическим соображениям по хлоридной проводимости.
Introduction
Channelrhodopsins (ChR) – световодные ионные каналы, которые происходят в пятне глаз подвижных зеленых водорослей, и служат в качестве первичных фотодатчиков для фототаксиса и фобических ответов 1 . С момента своего первого описания в 2002 году 2 , ChRs проложили путь к появляющейся области оптогенетики и могут применяться во множестве возбудимых клеток, например, в скелетных мышцах, сердце или головном мозге 3 , 4 , 5 . Экспрессия ChRs в клетках-мишенях приводит к светопропусканию ионной проницаемости соответствующей клетки. В нейронном контексте это позволяет активацию 6 , 7 , 8 или торможение 9 , 10 срабатывания потенциала действия (АР), в зависимости от проводимого иона, с пространственным и временнымТочность света, подчеркивающая, как избирательность ионов варианта ChR определяет его оптогенное применение.
Первые обнаруженные ChRs Chlamydomonas reinhardtii и Volvox carteri проницаемы для протонов, но также и с одновалентными катионами, такими как натрий, калий и в меньшей степени с двухвалентными катионами, такими как кальций и магний 11 , 12 , 13 . Сегодня более 70 природных катионопроводящих каналов (CCR) 14 , 15 , 16 , 17 и несколько инженерных вариантов 18 , 19 , 20 с различными свойствами, такими как Размер фототока, спектральная чувствительность, кинетика и селективность по катионам. Тогда как в неврологии CCRs aИспользуемые для активации клеток и запуска AP, световодные микробные насосы были единственными доступными антагонистами для блокирования нейронов в течение многих лет. В 2014 году две группы одновременно показали, что CCRs могут быть преобразованы в анион-проводящий канал -родопсины (ACR) путем изменения полярности вдоль предполагаемой проводящей поры через молекулу 9 , 21 . Впоследствии, природные ACR были идентифицированы в нескольких криптофитных водорослях 22 , 23 , 24 . Самое главное, легкая активация ACR опосредует хлорид-токи у взрослых нейронов, что позволяет ингибировать активность нейронов при гораздо меньшей интенсивности света, чем микробные насосы, которые переносят только отдельные заряды на поглощенный фотон.
Активность ChR может быть непосредственно устранена с помощью электрофизиологических патч-клеточных записей светоиндуцированных токов в клетках НЕК293. Патч-зажимТехника была изначально разработана в конце 1970-х годов 25 и дополнительно улучшена Хамилем и др. , Что позволяет регистрировать сущность токов из малой ячейки (режим цельной ячейки) с высоким текущим разрешением и прямым управлением напряжением 26 мембраны. Применяемый в культуре клеток, этот метод обеспечивает точный контроль как ионных, так и электрических условий регистрации, а также позволяет исследовать селективность ионов наряду с относительным вкладом ионов в общий ток. Здесь мы проиллюстрируем исследование избирательности ионов для анион-проводящего канала rhodopsin Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 посредством регистрации вольт-амперных отношений при различных концентрациях внеклеточного хлорида, чтобы доказать высокую проводимость хлорида.
Protocol
Representative Results
Discussion
Определение потенциалов реверсии при определенных ионных и электрических условиях дает информацию об ионах, транспортируемых после легкой активации ChRs. Если в сложной физиологической среде изменяется только один ионный вид, а полученный потенциал разворота изменяется в соответстви…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Майлу Рех, Тарсану Тармалингам и особенно Altina Klein за отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана Немецким исследовательским фондом (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 – PH) и Кластером совершенства, объединяющим концепции в области катализа, UniCat, BIG-NSE (JV) и E4 (PH).
Materials
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E.coli/ | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E.coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
References
- Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle. Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Li, X., et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).
- Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).
- Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), 409-412 (2014).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).
- Tsunoda, S. P., Hegemann, P. Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation. Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).
- Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. Ion selectivity and competition in channelrhodopsins. Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).
- Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride. MBio. 2 (3), 1-9 (2011).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis. J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).
- Hou, S. -. Y., et al. Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins. Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).
- Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a., Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).
- Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel. Science. 344 (6182), 420-424 (2014).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin. Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).
- Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata. J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
- Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).
- Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
- Amtmann, A., Sanders, D. A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes. J. Exp. Bot. 48, 361-364 (1997).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. Using microelectrodes. Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).
- Prigge, M., et al. Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics. J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).
- Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. Rectification of the channelrhodopsin early conductance. Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
- Wietek, J., Prigge, M. Enhancing Channelrhodopsins: An Overview. Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).
- Ferenczi, E. A., et al. Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability. Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).
- Sugiyama, Y., et al. Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2. Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).
- Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).
- Wang, H., et al. Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas. J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).
- Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).
- Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).
