Summary

Full-cell Patch-clamp Gravações para determinação eletrofisiológica de Ion Selectivity em Channelrhodopsins

Published: May 22, 2017
doi:

Summary

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Abstract

Ao longo da última década, os channelrhodopsins tornaram-se indispensáveis ​​na pesquisa neurocientífica onde eles são usados ​​como ferramentas para manipular não-invasivamente processos elétricos em células-alvo. Neste contexto, a selectividade iónica de uma canalrhodopsina é de particular importância. Este artigo descreve a investigação da seletividade de cloretos para uma canalrhodopsina de Proteomonas sulcata, condutora de aniões, recentemente identificada, por meio de gravações electrofisiológicas em células HEK293. O procedimento experimental para a medição de fotocorrentes de luz-gated exige uma fonte de luz rápida comutável – idealmente monocromática – acoplada ao microscópio de uma instalação de patch-clamp, de outra forma convencional. Os procedimentos preparativos antes da experiência são descritos envolvendo a preparação de soluções tamponadas, considerações sobre potenciais de junção de líquidos, semeadura e transfecção de células e puxar de pipetas de remendo. A gravação real da relação tensão-correnteS para determinar os potenciais de reversão para diferentes concentrações de cloreto ocorre 24 h a 48 h após a transfecção. Finalmente, os dados eletrofisiológicos são analisados ​​com respeito a considerações teóricas de condução de cloreto.

Introduction

Channelrhodopsins (ChR) são luz-gated canais iônicos que ocorrem na mancha do olho de algas verdes motile, e servem como fotossensores primários para phototaxis e respostas fóbicas [ 1] . Desde sua primeira descrição em 2002 2 , os CHRs abriram o caminho para o campo emergente da optogenética e podem ser aplicados em uma variedade de células excitáveis, por exemplo, dentro dos músculos esqueléticos, do coração ou do cérebro 3 , 4 , 5 . A expressão de ChRs em células alvo resulta na permeabilidade iónica controlável pela luz da respectiva célula. Num contexto neuronal, isto permite a activação 6 , 7 , 8 ou inibição 9 , 10 de potencial de acção (AP) disparando – dependendo do ião conduzido – com o espaço e temporalPrecisão da luz enfatizando como a seletividade iónica de uma variante ChR determina sua aplicação optogenética.

Os primeiros ChRs descobertos de Chlamydomonas reinhardtii e Volvox carteri são permeáveis ​​aos prótons, mas também aos catiões monovalentes como o sódio, o potássio e, em menor grau, os catiões divalentes como o cálcio eo magnésio 11 , 12 , 13 . Actualmente, mais do que 70 canais de canal condutores naturais (CCR) 14 , 15 , 16 , 17 e várias variantes de engenharia 18 , 19 , 20 com propriedades diferentes tais como Tamanho da fotocorriente, sensibilidade espectral, cinética e selectividade catiónica. Considerando que em neurociência, CCRs aRe usado para ativar as células e disparar APs, bombas microbianas conduzidas pela luz foram os únicos antagonistas disponíveis para silenciar neurônios por anos. Em 2014, dois grupos demonstraram simultaneamente que os CCRs podem ser convertidos em canalrhodopsins condutores de aniões (ACRs) por alteração da polaridade ao longo do suposto poro de condução iónica através da engenharia molecular 9 , 21 . Subseqüentemente, os ACRs naturais foram identificados em várias algas criptofitas 22 , 23 , 24 . Mais importante ainda, a ativação de luz de ACRs medeia as correntes de cloreto em neurônios adultos permitindo a inibição da atividade neuronal em intensidades de luz muito menores do que as bombas microbianas que apenas transportam cargas únicas por fóton absorvido.

A actividade de ChR pode ser direccionada directamente por gravações electrofisiológicas de "patch-clamp" de correntes induzidas pela luz em células HEK293. O grampo de fixaçãoTécnica foi originalmente desenvolvida no final da década de 1970 25 e melhorada por Hamill et al. , Permitindo a gravação da entidade de correntes de uma célula pequena (modo célula inteira) com alta resolução de corrente e controle direto da tensão da membrana 26 . Aplicada em cultura de células, esta técnica proporciona um controlo preciso das condições de gravação iónicas e eléctricas e permite estudar a selectividade dos iões juntamente com a contribuição relativa dos iões para a corrente total. Aqui, exemplificamos o exame da seletividade iónica para a canalrhodopsina condutora de ânions de Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 através do registro das relações tensão-corrente em várias concentrações de cloreto extracelular para provar alta condutância ao cloreto.

Protocol

Figura 1: Configuração do Patch-clamp. (1) fonte de luz, (2) fibra óptica, (3) obturador programável, (4) digitalizador, (5) obturador, (6) amplificador, (7) sistema de perfusão, (8) computador pessoal, , (10) gaiola faraday, (11) fase de microscópio, (12) entrada de perfusão, (13) saída de perfusão, (14) câmara de gravação, (15) (22) Microscópio invertido, (21) Microscópio lâmpada, (2…

Representative Results

A Figura 2 mostra resultados representativos obtidos a partir de medições seguindo o protocolo descrito. Durante a iluminação com luz verde, Ps ACR1 apresenta uma corrente transitória rápida que decai rapidamente para um nível de corrente estacionária. Depois que a luz é desligada, as fotocorrentes decaem para zero em milissegundos ( Figura 2A ). A troca da concentração de cloreto extracelular provoca um deslocamento do potencia…

Discussion

A determinação de potenciais de reversão em condições iónicas e elétricas definidas fornece informações sobre a espécie de íons transportada após a ativação leve de ChRs. Se exclusivamente uma espécie de iões é variada num meio fisiológico complexo e o potencial de reversão obtido se desloque de acordo com o potencial teórico de Nernst, esta espécie de iões é a única transportada.

No entanto, para ChRs, reversão potenciais turnos são geralmente menos pronunciada do …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Maila Reh, Tharsana Tharmalingam e especialmente a Altina Klein pela excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Pesquisa Alemã (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 a PH) e o Cluster of Excellence Unifying Concepts em Catálise, UniCat, BIG-NSE (JV) e E4 (PH).

Materials

HEK293 cells Sigma Aldrich 85120602 Human embryonic kidney cells
Retinal Sigma Aldrich R2500 all-trans retinal
FuGENE HD Promega E2312 Transfection reagent
DMEM Biochrome FG 0445 Dulbecco's Modified Eagle Medium
Agarose Roth 3810 Agar bridges
CaCl2 Roth 5239 CaCl2 2H2O
CsCl Biomol 2452
EGTA Roth 3054
FBS Biochrome S0615 Cell culture
Glucose Roth HN06 D(+)-Glucose
KCl Roth 6781
MgCl2 Roth 2189 MgCl2 6H2O
NaCl Roth 3957
NMG Sigma Aldrich M2004 N-Methyl-D-glucamine
Na-Aspartate Sigma Aldrich A6683 L-Aspartic acid sodium salt monohydrate
Citric acid Roth 6490
AgeI ThermoFischerScientific ER1462 Restriction enzyme
XhoI ThermoFischerScientific ER0695 Restriction enzyme
NheI ThermoFischerScientific ER0975 Restriction enzyme
XL1Blue E.coli/ Agilent Technologies 200249 Chemocompetent E.coli
Kanamycin Roth T832
Lysogeny broth medium Roth X964
Agar-Agar Roth 6494 Agar plates
Plasmid purification kit Marchery-Nagel 740727.25
Penicilin/Streptomycin Biochrome A 2213 Cell culture
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma Aldrich P6407-5MG Cover slip coating
Microforge Custom made Fire polishing
Serological pipettes TPP Different sizes
Clean bench Kojair Biowizard SL130
Stirrer IKA RCT classic
Silver wire Science Products AG-T25; AG-T10 Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode)
pH-meter Knick 765 Calimetric
Osmometer Vogel OM 815
Microscope Carl Zeiss ID03 Fire polishing
CO2 incubator Binder CB150
Cell culture dishes TPP 93040 34 mm internal diameter
Cover slips Roth P232 15 mm diameter
Thermometer Rössel Messtechnik MTM12
Beamsplitter Chroma 21011 90/10 transmission
Pipette holder ALA Scientific Instruments PPH-1P-AXU-0-1.5
Headstage Molecular Devices CV203BU
Amplifier Molecular Devices AxoPatch200B
Digitizer Molecular Devices DigiData1400 Digital analog converter
Lightsource TILL Photonics Polychrome V Set to 540 nm full intensity
Microscope Carl Zeiss Axiovert 100
Shutter Vincent Associates VS25
Shutter driver Vincent Associates VCM-D1
Glass capilarries Warner Instruments G150F-3 Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID  0.86 mm
Micropipette puller Sutter Instruments P1000
Bath handler Lorenz Messgerätebau MPCU
Tripleband filterset Chroma 69008 Fluorescence filter  ECFP/EYFP/mCherry 
CCD camera Watec Wat-221SCCD
Optometer Gigahertz Optik P9710 Measure light intensities
Objective Carl Zeiss 421462-9900-000 W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
Micromanipulator Scientifica PatchStar
Recording chamber Custom made
Power supply Manson HCS-3202 Avoids electrical noise from microscope built-in power supply
Vibration isolated table Newport M-VW-3636-OPT-01
Faraday cage Custom made or any commercial matching table
Hoses Any comercial; e.g. Roth Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges
Linear shaker Sunlab Instruments SU 1000
Liquid junction potential calculator Molecular Devices or directly from Peter H. Barry Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from  p.barry@unsw.edu.au
Data acquisition software Molecular Devices Clampex 10.X
Data evaluation software Molecular Devices Clampfit 10.X
PsACR1 GenBank or Addgene KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 Gene encoding for PsACR1
Amplifier guide Molecular Devices The Axon Guide

References

  1. Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
  2. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
  3. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle. Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).
  4. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
  5. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
  6. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  7. Li, X., et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).
  8. Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).
  9. Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), 409-412 (2014).
  10. Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).
  11. Tsunoda, S. P., Hegemann, P. Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation. Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).
  12. Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. Ion selectivity and competition in channelrhodopsins. Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).
  13. Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride. MBio. 2 (3), 1-9 (2011).
  14. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis. J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).
  15. Hou, S. -. Y., et al. Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins. Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).
  16. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  17. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
  18. Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).
  19. Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a., Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).
  20. Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel. Science. 344 (6182), 420-424 (2014).
  21. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin. Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).
  22. Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata. J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).
  23. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
  24. Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).
  25. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).
  26. Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
  27. Amtmann, A., Sanders, D. A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes. J. Exp. Bot. 48, 361-364 (1997).
  28. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  29. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).
  30. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  31. Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. Using microelectrodes. Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).
  32. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).
  33. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  34. Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).
  35. Prigge, M., et al. Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics. J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).
  36. Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. Rectification of the channelrhodopsin early conductance. Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).
  37. Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
  38. Wietek, J., Prigge, M. Enhancing Channelrhodopsins: An Overview. Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).
  39. Ferenczi, E. A., et al. Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability. Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).
  40. Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).
  41. Sugiyama, Y., et al. Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2. Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).
  42. Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).
  43. Wang, H., et al. Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas. J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).
  44. Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).
  45. Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).

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Grimm, C., Vierock, J., Hegemann, P., Wietek, J. Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins. J. Vis. Exp. (123), e55497, doi:10.3791/55497 (2017).

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