JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Genetik Kodlanmış Floresan Nitrik Oksit Uygulama (• NO) Tek Hücrelerde YOK • Sinyallerin Gerçek zamanlı Görüntüleme için sondalar, geNOps,

Published: March 16, 2017
doi:
10.3791/55486
, , , , , , , , , , , , ,
1Institute of Molecular Biology and Biochemistry,Medical University of Graz

Summary

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO•) probes (geNOps) to monitor single cell NO• fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO• formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

Abstract

Nitrik oksit (NO •) memeliler, bakteriler ve bitkilerde çok önemli hücresel fonksiyona aracılık olan küçük bir radikaldir. In vivo ve in vitro olarak hiçbir • tespit edilmesi için yöntemler, çok sayıda varlığına rağmen, tek hücre düzeyinde hiçbir • gerçek zamanlı izleme, çok zordur. NO • fizyolojik ya da patolojik etkileri gerçek konsantrasyonu tarafından belirlenir ve bu radikal bekleme süresini vardır. Buna uygun olarak, • tek hücreli algılanmasını sağlar yöntemler yüksek ölçüde istenebilecektir. Son zamanlarda, biz doğrudan dolayısıyla bu ihtiyacı giderir, hücresel YOK • dalgalanmalara tepki ve tek floresan protein bazlı genetik olarak kodlanmış nitrik oksit (NO •) sondalar (geNOps) tanıtarak YOK • göstergelerin palet genişletti. Burada NO • iki farklı kimyasal -liberating moleküllere yanıt olarak, hücre içi NO • sinyallerini değerlendirmek için geNOps kullanımını göstermektedir. Bizim sonuçlarımız alsile karşılaştırıldığında, taze 3- (2-hidroksi-1-metil-2-nitrosohydrazino) -N-metil-1-propanamin hazırlanan O onaylamak (NOC-7) hücre içi NO • seviyelerindeki değişimi uyandırmak için çok daha yüksek bir potansiyele sahip inorganik YOK • donör sodyum nitroprussid (SNP). Ayrıca, yeşil geNOps (G-GENOP) ve kimyasal Ca 2 + göstergesi fura-2 kullanılarak iki renkli canlı hücre görüntüleme Ca 2 + sıkı düzenleme görselleştirmek için yapıldı bağımlı NO • Tek endotel hücreleri oluşumu. Bu temsilci deneyler geNOps çeşitli deneysel kurulumları tek hücreli YOK • sinyallerinin gerçek zamanlı nesil ve bozulmasını araştırmak için uygun araçlar olduğunu göstermektedir.

Introduction

Son zamanlarda, genetik olarak kodlanmış flüoresan NO • probları yeni bir sınıfını gelişmiş geNOps 1 denilen. Bu sensörler bir tat floresan protein (FP) varyant 3. (mavi, yeşil veya turuncu FP) konjüge olan bir sadece inşa, bakteri kaynaklı NO • bağlama alanı 2, oluşur. NO geNOps olan heme-olmayan demir (ll) merkezi 4'e bağlanma • hemen floresan yoğunluğu 1 azaltır. Hücre içi NO • seviyeleri 1 düşüş olduğunda da önemlisi, geNOps floresan hızla ve tamamen kurtarır. Buna göre, geNOps (alt) hücresel YOK • dalgalanmalar gerçek zamanlı görüntüleme sağlar. geNOps NO • algılama mekanizması bugüne kadar belirsizliğini koruyor olsa da, onlar mükemmel YOK • muhabiri olmak ve böylece çok renkli, kantitatif YOK • bioimagin yeni bir çağ açmak için güce sahip kanıtlanmıştıryüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte 1 ile g, 5. Diğer mevcut floresan YOK • sondalar hücrelere yüklenmesi gerekiyor ve geri dönüşümsüz NO • 6 ile değiştirilen küçük kimyasal bileşikler, dayanmaktadır. YOK • duyarlı küçük fluorophores Ek dezavantajları zor güvenilir, analitik ve kesin bir şekilde 7, 8, 9 bunları kullanmak için yapmak potansiyel sitotoksisite ve nispeten düşük özgüllük vardır. Genetik olarak kodlanmış floresan prob etkin kullanımı verimli gen transferi teknikleri gerektirmesine rağmen, FP tabanlı genetik olarak kodlanmış sensörler hücreleri 10, 11 iç işleyişi anlayışımızı devrim vazgeçilmez araçlar olarak ortaya çıkmıştır. Bir F tek FP tabanlı geNOps gelişiminden önceörster rezonans enerji transferi (FRET), NO • sensörü tabanlı NOA-1 12, inşa edilmiş olarak anılacaktır. Sato ve diğ. NO • -duyarlı çözünebilir guanilat siklazın, iki alt-birimden (sGC), siklik guanosin monofosfatın (cGMP) 12 raporlama iki konjuge FRET bazlı sensörler oluşur, bu karmaşık prob tasarlanmıştır. Bu sonda cGMP yanıt olarak, sadece dolaylı olarak hücre içi YOK • dalgalanmaları 12 algılar. NOA-1 nano-molar aralıkta YOK • yüksekliklerde yanıt olsa da, bu araç muhtemelen bu hantal ikili sensör kullanılabilirliği ve uygulanabilirliği konusunda sınırlamalar, bugüne kadar sık ​​kullanılan olmamıştır.

Darbe temel biyolojik süreçler de 13, 14 karakterize edilmiştir YOK •, çok yönlü fonksiyonları. Birçok çalışma kanıtladı YOK • concentration hücreleri ve alt dahilinde sağlığı ve hastalıkları 14, 15, 16 hücre kaderini belirler. Memelilerde NO • esas olarak iyi karakterize nitrik oksit sentaz (NOS) ailesi 17 çeşitli hücre tiplerinde enzimatik oluşturulur. Şimdiye kadar, NOS'un üç izoform 19, 20, 18 tarif edilmiştir; Bu Ca 2 + / kalmodulin bağımlı endotelyal NOS (eNOS veya NOS-3) 18 ve nöronal NOS (nNOS veya NOS-1) 19, ve Ca 2+ / kalmodulin bağımsız yapısal olarak aktif indüklenebilir NOS (iNOS veya nos vardır 2) 20. Ayrıca, mitokondriyal NOS (mtNOS) varlığı, aynı zamanda 21 öne sürülmüştür. Ancak, mtNOS nNOS bir ekleme varyantı olarak kabul edilir ve bu nedenle ayrı olarak sınıflandırılır değil bir izoformu 21 olarak. Başka bir izoform olan ayrı memeli hücrelerinde olanlardan adlandırılan bakteriyel NOS (BNOS), en başta, Gram-pozitif bakteriler 22 bulunur. NO • enzimatik üretimi son derece adenin dinükleotid (FAD), tetrahidrobiyopterin (BH4), moleküler oksijen ve L-arginin 17 flavin, kontrollü ve nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) gibi çeşitli kofaktör bulunmasına bağlıdır edilir. Katyonik amino asit L-arginin NO • üretimi 17 üzerine L-sitrulin dönüştürülür substrattır. NO • son derece düzenlenmiş enzimatik oluşturulmasına ek olarak, radikali hipoksik koşullarda 23 altında mitokondrilerde nitrit havuzlarından enzimatik olmayan azaltılabileceğini ileri sürülmüştür. NO • bir hücre içinde üretilen sonra, serbest biyolojik zarlarda 14 boyunca yayılmadan,ref "> 15. Ancak, bu radikal çok kısa yarı ömrü çoğunlukla çevre koşulları tarafından belirlenmektedir ve çeşitli yollar ve kimyasal reaksiyonlar verimli YOK • seviyelerini 24 aşağılamak. Sonunda, NO • oluşumu, difüzyon ve yıkımı bağlıdır farklı çevresel parametreler ile ilgili olan çok biyolojik olarak aktif molekülün 24 etkin konsantrasyonunu belirlemek.

GeNOps teknolojisi (alt) hücresel YOK • dalgalanması 1 doğrudan algılanmasını sağlar ve yeniden incelemek nedenle uygundur ve yeni hücresel YOK • sinyallerinin birikimi ve ayrışma sorumlu mekanizmalarını keşfetmek. Burada, tek tek hücrelerin düzeyinde, basit protokoller ve dışsal olarak uyarılmış görselleştirmek için geNOps kullanımına yönelik temsili sonuçlar ve endojen üretilen NO • profilleri sağlar. Ayrıca, geNOps teknolojisi AP için uyarlanabilirdiğer hücre modeli sistemlerinde plikasyon çeşitli hücresel uyaranlara ve strese yanıt olarak YOK • formasyonu, difüzyon ve yıkımı karmaşık desenleri incelemek için.

Protocol

Kimyasal Tamponlar ve Çözümleri 1. Hazırlık 135 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 2.6 mM NaHCO 3, 0.44 mM KH 2 PO 4, 0.34 mM Na 2 HPO 4, 10 mM D-ihtiva eden bir saklama tamponu hazırlayın glukoz, 2 mM L-glutamin, 1 x MEM vitamin, 1 x MEM amino asitler,% 1 kalem strep, ve% 1 amfoterisin B, distile su içinde tüm bileşenleri çözündürülür ve oda sıcaklığında, bir manyetik karıştırıcı kullanılarak 20 dakika boyunca tamponu ilave edin. 1 M NaOH ile 7,44 pH ayarlayın. NaOH damla damla üzerine, sürekli bir şekilde karıştırılarak, bir pH metre kullanılarak pH ölçer. 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM CaCI2, 1 mM MgCI2, 10 mM D-glikoz, 10 mM HEPES oluşan fizyolojik Ca2 + içeren tampon hazırlayın. aşama 1.1 'de tarif edildiği gibi NaOH kullanılarak 7.4'e pH ayarlayın. Aynı maddeler oluşur Ca 2 + -ücretsiz tampon hazırlayınolarak adım 1.2 listelenen. 1 mM EGTA yerine 2 mM kullanın. 1 mM stok solüsyonu elde etmek için, DMSO içinde, Fura-2AM çözünür. en fazla bir ay süreyle -20 ° C'de stok sıkıca kapalı şişelerde çözüm ve mağaza alikotu. dondurulmuş bir stok çözeltisi ışıktan koruyarak en az 1 saat boyunca oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın. 3,3 uM değerinde bir nihai konsantrasyon elde etmek üzere, 1 ml saklama tamponu (adım 1.1) içinde, Fura-2AM stok solüsyonu ile seyreltilir. damıtılmış su içinde 100 mM stok çözeltisi, histamin 1 ml (pH 7.0) hazırlayın. 100 uM histamin nihai bir konsantrasyona kadar fizyolojik tampon ihtiva-eden 100 mi Ca2 + içinde 100 mM stok çözeltisi, histamin seyreltilir. 300 uM'lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere, kalsiyum ihtiva eden fizyolojik tampon 100 ml Nω-nitro-L-arginin (L-NNA) çözünür. L-NNA tamamen eriyene kadar en az 1 saat boyunca 37 ° C su banyosunda çözüm saklayın. 10 mg çözünür NOC-7 distile water (pH 7.0), 10 mM stok solüsyonu elde edilmiştir. sıkıca kapatılmış şişeler içinde küçük kısımlar halinde, stok çözeltisi eş-payı ve -70 ° C 'de hemen saklayın. 10 uM NOC-7 bir son konsantrasyon elde etmek için fizyolojik bir tampon maddesi içinde NOC-7 stok çözeltisi ile seyreltilir. NOT: NOC-7 kendiliğinden kısa bir yarılanma ömrü ile NO açığa çıkaran bir küçük kimyasal bileşiktir. Her zaman hemen önce her bir deney için NOC-7 oluşur çalışma tamponlar hazırlamak. fizyolojik kalsiyum tamponu içinde 1 mM sodyum nitroprussid (SNP) çözeltisi yapma ve 10 uM seyreltme hazırlar. NOT: Her zaman küçük miktarlarda nedeniyle hızla bozulma oranı NO verici çözümleri (~ 10 ml) hazırlamak. Bir HPO 4, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 9.2 mM Na-2 oluşan fosfat tamponlu çözelti (PBS) ve 1.5 mM KH 2 PO 4 hazırlayın. NaOH / HCl ile 7.44 pH değerini ayarlayın. 2. Hücre Hazırlanması NOT: o olarakSarf, hücreler bir demir Fe2 + eski haline getirilmesi için görüntüleme deneyleri öncesinde tampon içeren (II) / C vitamini ile önceden inkübe gereken geNOps kullanılarak tek hücre nitrik oksit (NO •) ölçüm performansında bir tekdüzeliği elde etmek NO • -probes NO • -bağlayıcı etki alanı içinde. EA.hy926 ve HEK293 hücreleri durumunda, demir (II) takviye çözeltisi ile 20 dakika süreyle inkübasyon NO • sensörlerin tam aktivasyonuna yol açar. 6-çukurlu plaka bir oyuğuna 30 mm'lik mikroskop kapak gözlük ertesi gün için 5.5 X 10 5 EA.hy926 veya HEK293 hücrelerini ya da ertesi gün için gün sonra 3.5 x 10 5 hücre, tohum. % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir ortamda 37 ° C'de inkübe hücreleri. Not: memeli hücreleri ve virüs yapı adenoviral enfeksiyonu ile ilgili detaylı bilgi Zhang ve arkadaşları tarafından tarif edilmiştir. 25. Bu adım, kararlı bir şekilde G-GENOP ifade eden HEK 293 hücreleri için geçerli değildir. cenin buzağı serumu (FCS) ve antibiyotik içermeyen Dulbecco Kartal modifiye ortam maddesi (DMEM) almak ve G-GENOP (İB kodlayan gen taşıyan adeno bağlantılı virüs tip 5 (AAV5) vektörü ekleyin: EA.hy926 hücreleri için, 500 yaklaşık 100 verim % pozitif hücreler; İçişleri Bakanlığı: 1 HEK293 hücreleri için verimli). NOT: adeno-ilişkili viral vektörlerin kullanılması 2. Biyogüvenlik düzeyi 2 çevreleme genellikle bu vektör ile çalışmak için gerekli olan risk grubuna atanır. Gerekirse, virüs enfeksiyonu, aynı zamanda ortam içeren FCS gerçekleştirilebilir. Seçenek olarak ise, hücreler, geçici olarak lipid tabanlı taşıyıcılar 1 kullanılarak transfekte edilebilir. Kültür Ortamı çıkarın ve önceden ısıtılmış (37 ° C), hücreler PBS ile yıkayın. 1 saat boyunca her bir DMEM / AAV5 ortamın 1 ml ilave edilir. Bu adım, kararlı bir şekilde G-GENOP ifade eden HEK 293 hücreleri için geçerli değildir. % 10 FCS bir son konsantrasyona kadar her bir% 20 FCS içeren DMEM ile 1 ml ilave edilir. hücrelerden AAV5 içeren ortamını çıkarmayın. centilmenly kuyu içinde ortamı homojenize etmek için plaka silkelenerek. % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosfer altında 37 ° C'de 48 saat boyunca inkübe hücreleri. Bu adım, kararlı bir şekilde G-GENOP ifade eden HEK 293 hücreleri için geçerli değildir. 48 saat sonra, önceden ısıtılmış hücrelerin PBS ile yıkayın. Daha sonra ışık ışınlarından korunmaktadır en az 1 saat oda oda sıcaklığında hücreler, her bir 2 ml önceden ısıtılmış bir depolama tamponu (Bölüm 1.1) ekleyin ve inkübe edilir. Oda sıcaklığında / oyuk demir (ll) güçlendirici çözeltisi, 1 ml (RT), depolama tamponu değiştirin. karanlıkta tam olarak 20 dakika süreyle inkübe hücreleri. NOT: aşması veya bu YOK • prob yanıt etkileyebilir optimal kuluçka süresini azaltmak etmeyin. Depolama tamponu ile bir kez hücreler yıkanır ve hücrelerin dengelenmeye olanak sağlamak için oda sıcaklığında en az 2 saat süreyle 2 mi, depolama tamponu ile de, her inkübe edin. Oda sıcaklığında 45 dakika süre ile, 1 ml saklama tamponu içinde 3.3 uM Fura-2AM ile birlikte depolama tamponu yerine korunanışıktan. Hücreler dengelenmeye olanak sağlamak için en az 30 dakika boyunca bir kez daha, bir depolama tamponu ile hücreler iki kez yıkanır ve inkübe edilir. Bireysel Hücrelerde Hayır • ve Ca 2+ Sinyalleri 3. Canlı Hücre Görüntüleme bir metal perfüzyon odasına (adım 2.1) EAhy.926 veya HEK293 hücreleri ile kaplanmış bir 30 mm kapak kayma saptamak mikroskop üzerine yerleştirin. Tampon rezervuarlara tutucu bir tüp ve bir vakum pompasına akışını bağlayın. tutarlı bir akış sağlamak ve kapak kayma boşalmasını önlemek. yarı otomatik perfüzyon sistemi kullanılarak (Aşama 1.2), fizyolojik kalsiyum tamponu ile yerçekimi ile çalışan bir perfüzyon başlatın. NOT: Bu tür bir sistem bir tampon rezervuar, ilgili boru, manyetik, elektronik olarak kontrol edilir valf ve bir vakum pompası (Şekil 1B'ye bakınız) oluşur. akış hızı perfüzyon rezervuar yüksekliğine bağlı olarak 1 ila 3 ml / dakika, arasında olabilir. Tutarlı yerel uyuşturucu başvurunun içinkatyonu, kullanılan tüm rezervuar akış hızı, yaklaşık olarak eşit olmalıdır. Bu görüntüleme deneyleri öncesinde test edilmelidir. endotel hücrelerinin sıkı perfüzyon ile indüklenebilir olarak kesme baskısı arttırılır yanıt olduğunu göz önünde bulundurun. görüntüleme sistemini çalıştırmak ve 30 dakika boyunca tüm aygıtların kadar ısınmasına izin verildi. İlgili yazılım kullanarak görüntüleme ayarlarını tanımlayın. Seç dalgaboyu 340 nm ve fura-2 görüntüleme için 380 nm ve heyecan verici G-GENOP için 480 nm. floresan beyazlatma 4 kamera binning artırmak ve uyarma yoğunlukları ve maruziyet sürelerini azaltmak en aza indirmek için. Ayrıca bakınız 3.6-3.8 adımları tekrarlayın. NOT: Görüntüleme ayarları ve parametreleri kullanılan cihazlar bağlıdır, fura-2 yükleme verimliliği ve G-GENOP ifade seviyeleri. Birkaç floresan hücrelerin kadar mikroskop xyz-tablosunu hareket ettirerek görüntüleme bölge seçin odak vardır. Sonra ilgili yazılım aracı ile ilgi (ROI) bölgeleri tanımlar. Birden fazla tam singl kapsayan bölgeleri çizmekelle görüntüleme alanının başına e floresan hücreleri. Buna ek olarak, benzer büyüklükte bir arka bölgeyi tanımlar. NOT: görüntüleri elde ve ROI ayrıca ilgili görüntü analiz yazılımı kullanarak daha fazla analiz için görüntüleme işleminden sonra yeni tanımlanabilir saklandıktan sonra (Malzeme Listesine bakınız). motorlu örnek aşaması ile ters ve gelişmiş floresan mikroskop ve bir tek renkli ışık kaynağı verileri toplamaya başlar. Alternatif olarak, sırasıyla, G-GENOP 340 nm ve Fura-2AM 380 nm ve 480 nm 'de harekete geçirir. Tüm kanallar için, açık bir floresans sinyali, zaman içinde tespit edilebilir, böylece ilgili maruz zamana ayarlanır. Ayrıca 3.4 adıma bakınız. Not: Bu uyarma ışık yoğunluğu ve kamera binning bağlıdır. Örneğin, 15 uyarma ışık% yoğunluğu, 4 kamera binning ve 340 nm, 150 ms, 380 nm, 50 ms ve 480 nm 300 ms kullanımı. Ayrıca 3.4 adıma bakınız. fura-2 / am 510 nm, G-Geno için 520 nm'de yayılan ışık toplayın500 nm uyarıcı, bir 495 nm dikroik ve 510-520 nm yayıcı oluşan uygun filtre seti ile bir şarj çiftli aygıt (CCD) kamera kullanarak s. Tutanak bir toplam kare her 3 saniyede. Zamanla ilgili floresan sinyalleri taban çizgisini elde etmek için fizyolojik Ca 2 + tamponu (1.2) (3 dakikaya kadar gerekirse) ilk dakika kaydediniz. Sabit bir taban floresans bir gözlenmiştir, 3 dakika boyunca hücrelerini uyarma fizyolojik Ca 2 + tampon içeren 100 uM histamin veya ATP (1 uM ya da 100 uM) geçin. NOT: agonistler cevap EA.hy926 hücreleri ve G-GENOP floresan sinyalinin net bir azalma (340 380 nm'de heyecanlı floresan yoluyla bölünmüş nm'de heyecan floresan) fura-2 oranında keskin bir artış göstermektedir. Hücrelerinden bileşiklerin bertaraf edilmesi için 5 dakika için histamin veya ATP ve L-NNA olmadan geri fizyolojik Ca 2 + tampon geçin. Bu adım FLUORES kadar uzamış olabilirartmasına neden olmuştur değişiklikler tamamen iyileşti. Perfüzyon sistemi kullanılarak 2 dakika süreyle fizyolojik Ca 2 + tampon içinde 10 uM NOC-7 yönetmek. NO verici güçlü, genellikle 10 uM NOC-7 yanıt olarak>% 20 oranında azalır, G-GENOP floresan etkiler. EA.hy926 hücrelerinde NOC-7 efekt G-GENOP floresan söndürme kaynaklı agonist ile karşılaştırıldığında yaklaşık 3 kat daha güçlüdür. Tampon ve bir kez bazal floresan kurtarıldı kaydını durdurmak 2 + fizyolojik Ca yaklaşık 10 dakika süreyle YOK • -releasing bileşik yıkayın. 4. Veri Analizi İhracat verileri analiz yazılımı, zamanla tek hücre ortalama floresan yoğunluğu verileri elde etti. ilgili arka plan değerleri çıkarmak ve zamanla her bir hücrenin kendi fura-2 sinyallerinin 380 nm ile 340 nm oranı hesaplanır. Gerçek fl elde etmek için G-GENOP kanalının arka plan değerleri çıkarmakHerhangi bir hesaplama yazılımı kullanarak zamanla YOK prob (F) yoğunluğu uorescence. F 0 (F 0 uyarı olmaksızın zamanla YOK prob floresan olduğu) olarak bazal floresan değerleri alır. Ayrıca 4.5 ve Şekil 1C adım Bkz. Aşağıdaki denklem kullanılarak floresan beyazlatma etkileri zamanla bir işlev hesaplayın: F 0 = F açmasının • exp (-K • Zaman) + F plato. F açmasının: görüntüleme kez maksimum floresan sinyali başlatılır; K: Zamanla floresan beyazlatma hız sabiti; F plato: zamanla beyazlatma ulaşılan floresan asgari; Ayrıca bkz 4.3- 4.4 ve Şekil 1C adımları. Not: bir yaklaşım için, öncesinde ve hücre stimülasyonu sonrası zamanla tüm floresans değerleri kullanılabilir. Daha fazla ayrıntı Bentley ve ark tarafından belirtilir. 27. zamanla G-GENOP sinyali normalleştirmek için, hesaplamak 1-F / F0 (4,3-4,5 adımları). Şekil 1C ve 1D bakın.

Representative Results

Geçici Uygulamalı YOK Donörlerinde Cevabı Tek hücreli YOK • Profilleri görselleştirme Bu stabil olarak iki farklı NO açığa çıkartan, küçük kimyasal bileşiklerin yanıt olarak tek bir hücre-düzeyde bir • sinyalleri görselleştirmek için, G-GENOP (Şekil 1A) eksprese eden bir HEK hücre klonu, NOC-7 ve SNP kullanılır. NO • vericileri arka arkaya sürekli bir akışını (Şekil 1B) sağlanmış bir ağırlık tabanlı perfüzyon sistemi kullanılarak görüntüleme sırasında uygulanan ve hücreler çıkarıldı. Farklı yoğunluklarda G-GENOP ifade eden tüm hücreler • donör eklenmesi üzerine hücreler içinde hızlı hiçbir • birikimi gösteren, NOC-7 ve SNP (Şekil 1C) yanıt olarak floresans açık bir azalma olduğunu göstermiştir. Normalize floresan sinyalleri (1-F / F 0) YOK • Her iki vericileri homojen cellula uyarılmış olduğunu göstermiştirNO r • tamamen YOK • -releasing bileşikler (Şekil 1D) yıkanması sonucu geri kazanıldığı yükselmeler. Ancak, 10 uM SNP 10 uM NOC-7 (18.10 ± 1.20%, n = 3/38, s ulaşıldı sadece 50 hücresel YOK • sinyalinin% (9,63 ± 1,05%, n = 3/38) kaynaklı < 0.0001). NO donorları, • SNP 1 mM konsantrasyonu, gerekli (Şekil 1C, 1 D) iki eşit hücre içi NO • seviyelerini elde etmek için. Sonra, HEK hücreleri hücre içi YOK • seviyelerini yükseltmek için zaman aşımına uğramış NOC-7 karşı hazırlanan taze kapasitesini test etti. Bu amaçla, 5 uM NOC-7 ihtiva eden dört deney tampon hazırlandı. NO • verici ya taze hemen önce ölçüme eklenir ya da 1 saat, 2 saat ve ölçümden önce, oda sıcaklığında 3 saat için rezervuarların içinde tutuldu. Farklı tamponlar ardışık uygulanan ve f çıkarıldıBir perfüzyon sistemi (Şekil 2B) kullanan G-GENOP ifade hücreleri rom. Bu yaklaşım, beklendiği gibi gösterdi hücre içi YOK • seviyelerini (Şekil 2A, 2C) yükseltmesine zamanla kapasitelerini azalmış sulu NOC-7 çözümlerin istikrarı açıkladı. Taze NOC-7 (Şekil 2C), hücresel bileşenleri de sağlam YOK • -liberating moleküllerin belki belirten yapışma tarafından uyarılmış olan hücre içi NO • yanıta göre İlginçtir, NO • sinyaller, zaman aşımına uğramış tamponların çıkarılması üzerine önemli ölçüde daha hızlı iyileşti . Eşzamanlı Ca 2+ Görselleştirme ve NO • Tek Endotel hücrelerinde sinyaller Ca incelemek için 2 + endotel hücrelerinde NO • oluşumunu -triggered, yaygın olarak kullanılan endotel ölümsüzleştirilmiş hücre-taşıyıcı, EA.hy926 hücre hattı, t olduransiently G-GENOP ile transfekte edilmiş ve Fura-2 / AM ile yüklendi (Protokol 2.8). Transfeksiyon, G-GENOP pozitif endotel hücreleri, yaklaşık% 10 elde edildi (n = 6, Şekil 3A) Ca2 + kayıt için yeterli olan, tek bir endotel hücrelerinin düzeyde bir • üretimi -evoked. Bununla birlikte, bir adeno-bağlantılı virüs vektörü kullanılarak, yaklaşık% 100, G-GENOP pozitif EA.hy926 hücreleri elde (n = 6; Protokolü 2.2). Çok kanallı ölçümlerden önce, hücreler, L-NNA, güçlü bir geri dönüşü olmayan NOS inhibitörü 26 oluşan bir depolama tamponu içinde, oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edildi. Kontrol hücreleri, L-NNA (Protokol 1.1) (Şekil 3B) olmadan aynı saklama tamponu içinde tutulmuştur. Histamin, güçlü bir inositol 1,4,5-trifosfat (IP 3) üreten agonist anında yüksek sitosolik Ca agonisti kaldırma kadar hücre içi NO • bir kademeli bir artış ve ardından 2 + düzeyleri kontrol hücrelerinin tedavisid (Şekil 3C, 3D). Hücre içi NO • seviyesi histamin tepki (Şekil 3E) hemen hemen etkilenmemiştir ise NOS inhibitörleri ile önceden muamele edilmiş hücreler, içindeki sitosolik Ca2 + sinyali gösterdi. G-GENOP ifade EA.hy926 hücreler de 1 uM ile tedavi edildi ve 100 geNOps düşük fizyolojik ve üstü fizyolojik hem de tepki NO • sinyalleri izlemek için uygun olup olmadığı test etmek amacıyla agonist ATP üreten IP 3 uM bir agonist (Şekil 3F) konsantrasyonları. Endotel hücre hattı 1 um ATP yaklaşık 100 um ATP (Şekil 3F) ile elde edilen sinyalin yarısı açık bir sitozolik YOK • sinyali, uyarılmış. Şekil 1: Farklı NO-Liberti'nin cevaben hücre içi YOK profilleri moleküller ng. HEK hücreleri (A) geniş alan görüntüleri stabil olarak sitosolik G-GENOP eksprese. Ölçek çubuğu 20 mikron =. (B) NOC-7 ve SNP kontrollü bir uygulama ve çıkarılması için bir ağırlık tabanlı yarı otomatik perfüzyon sisteminin şematik gösterimi. (C) Temsilci (üzerinden 3 bağımsız deneyler) olmayan normalleştirilmiş tek hücreli floresan yoğunluğu mM stabil 10 uM NOC-7, 10 uM SNP yanıt sitozolik G-GENOP ifade eden HEK hücrelerinin zamana karşı keyfi birimlerinde izleri ve 1 SNP. Siyah kalın eğri 26 tek hücreli izleri ortalama eğrisi (açık gri eğrileri) temsil eder. Noktalı siyah eğri normalleşmesi için kullanılan F 0, temsil eder. (D) Normalize ve ters tek izleri (1-F / F 0, açık gri eğrileri) ve 10 uM NOC-7, 10 uM SNP, ve 1 mM SNP yanıt zamanla eğrisi (siyah kalın eğri) elde ortalama Panel C.es / ftp_upload / 55486 / 55486fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2: stabil G-GENOP ifade eden HEK hücreleri kullanılarak NOC-7 stabilitesi testi. Taze ve eski NOC-7 tampon çözümleri başvurusu üzerine HEK hücreleri ifade stabil G-GeNOps zaman içinde (A) Temsilcisi YOK • konsantrasyon tepki eğrisi. Tüm NOC-7 ihtiva eden tampon maddeler aynı stok çözeltisi (50 mM) ile 5 um'lik bir son konsantrasyona sahip ilk hazırlanmıştır. belirtildiği gibi 1 saat, 2 saat, 3 saat için görüntüleme tutarları kadar hazırlandıktan sonra ilgili çözümlerin geçmesi zaman. (B) ardışık ekleme ve görüntüleme sırasında NOC-7 içeren çözümler kaldırmak için bir yerçekimi bazlı yarı otomatik perfüzyon sisteminin şematik gösterimi. (C) Zamansal korelasyonyanıt hücresel YOK • sinyaller taze hazırlanan ve eski NOC-7 tamponlar için. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 3: HAYIR • ve Ca tek EA.hy926 hücrelerinde 2+ sinyallerinin aynı anda çok kanallı görüntüleme. (A), fura-2 / AM (orta ve sağ panel) ile yüklenir, G-GENOP (sol panel) eksprese EAhy.926 hücrelerinin Örnek geniş alan floresan ve görüntüler. Ölçek çubuğu 20 mikron =. (B), ölçümden önce altı oyuklu plaka içerisinde 20 dakika boyunca 500 uM Nω-nitro-L-arginin (L-NNA) ile EAhy.926 hücrelerinin tedavisi şematik gösterimi. (C) fura-2 (uyarma eşzamanlı kayıt Temsilcisi zaman ders: 340 nm / 380 nm emissiyonu 510 nm) ve G-GENOP sinyalleri (eksitasyon: 480 nm, emisyon: 520 nm): 100 uM histamin yanıt olarak. belirtilen histamin 3 dk bir perfüzyon sistemi kullandıktan sonra çıkarıldı olarak. (D) eğrileri sitozolik Ca eşzamanlı kayıtları temsil 2+ (fura-2 oranı sinyalleri F 340 / F 380 gri düz çizgi) ve NO • sinyalleri (normalize ve ters eğri, 1-F / F 0 yeşil katı çizgi) tek Fura-2 / zaman içinde geçici olarak, G-GENOP eksprese eden endotelyal hücre yüklü am. Hücreler, 3 tamponu ihtiva eden bir Ca2 + (2 mM CaCl2) içinde min (n = 8/3) için 100 uM histaminle uyarıldı. (E) Örnek aynı zamanda Ca 2 + (gri katı çizgi) kaydedilir ve NO • 500 uM Nω-nitro-L-arginin (L-NNA) ile önceden muamele edilmiştir, bir EA.hy926 hücre, zamanla (yeşil bir katı çizgi) sinyalleri önceden ölçüm (n = 12/3). Hücreler, 2 mM ile 100 uM histaminle tedavi edildiCa 2 +. (F), 100 uM ATP ile, ikinci bir hücre uyarımı ile devam eden 1 uM ATP yanıt olarak sitosolik NO • sinyalleri temsil eden ortalama eğrileri. Barlar 1 uM ATP (beyaz çubuk) ve 4 bağımsız deneyin 100 um ATP (yeşil çubuk) yanıt olarak maksimal G-GENOP sinyallerinin ± SD ortalama değerlerini temsil eder; p <0.001 vs 1 uM ATP. P-değeri eşleştirilmemiş t-test kullanılarak hesaplandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Biyoloji 28 önemli bir sinyal molekülü olarak hiçbir • keşfinden beri, tek hücreler, doku ve uygulanabilir ve güvenilir bir şekilde yüksek çözünürlük ile bütün hayvanlarda kökü spesifik gerçek zamanlı ölçüm aspire edilmiştir. Burada geniş alan floresan mikroskobu 1 kullanarak tam YOK • sinyallerinin canlı hücre görüntüleme sağlayacak son zamanlarda geliştirilen genetik olarak kodlanmış floresan YOK • probları (geNOps) uygulamasını sunduk.

ayrıntılı ve invaziv transfeksiyon prosedürler stabil Eksojen üretilen tek hücreli YOK • profillerini ölçmek için kullanılan yeşil floresan G-GENOP ifade HEK hücre klonu aşmak için. HEK hücreleri normalde • endojen 29 üretmeyen, bu hücre tipi ko-kültür koşullarında diğer birçok uygulama için yararlı olabilecek bir GENOP tabanlı sensör hücre çizgisinin üretilmesi, için uygundurNO ile • birincil hücreler, hatta hayvanlara 30 yaşayan üreten. Ancak, bu çalışmada biz, G-GENOP ifade eden HEK hücre modeli kullanılarak hücre içi YOK • sinyallerini uyandırmak için farklı konsantrasyonlarda ve kararlılıkları çeşitli YOK • -liberating bileşiklerin kapasitesini, göstermektedir. Bizim verilerimiz uygulama NO • -donor konsantrasyon, kalite ve yöntem sonunda hücre içi NO • profillerin kalıplarını belirleyen ortaya çıkarmıştır. Bu tür bilgiler çeşitli hastalıkların göstergesidir farklı YOK • donörlerin, in situ farmakokinetik karakterizasyonu için vazgeçilmezdir. Özellikle, geNOps stabil çok uzun bir süre üzerinde 1 YOK • -donor bakliyat çoklu tekrarlı uygulamalar yanıt vermek için gösterilmiştir. Buna göre, burada sunulan bileşiklerin -liberating • NO kullanarak deneyler, çeşitli genlik ve ilgili hücresel NO kinetik ilişkin yarı-kantitatif sonuçlar izin226; sinyalleri (Şekil 1 ve 2).

Stabil olarak ifade eden HEK hücre klonu, muhtemelen tek bir hücreden kaynaklanan, ancak G-geNOps sentezleme seviyelerinin geniş bir heterojen (Şekil 1) görülmektedir. Bu ilgi (genom entegre) genin transkripsiyon, hücre büyüme oranları 32 etkileyen çeşitli çevresel streslere 31 gibi birçok faktör kontrolü altında stabil hücre klonlarının bir ortak özelliği olduğunu ve hücre döngüsü durumu 33. Tek FP tabanlı geNOps dolayısıyla, NO • GENOP ifade seviyesi 1 ile floresan yoğunluğu artar kaybı indüklenen olmayan oranlı metrik sondalar ve. Bu duruma göre, geNOps sinyallerinin normalleştirilmesi, özellikle karşılaştırmalı bir analiz durumunda hücresel NO • sinyalleri ölçülmesi için gereklidir. Bizim son çalışmada, sıkı bir doğrusal ilişki b gösterildiği gibietween geNOps bazal floresan yoğunluğu ve floresan yoğunluklarının geniş bir aralığı üzerinde hiçbir • indüklenen floresans gücü 1 olduğu bulunmuştur. Bu hücresel YOK • sinyallerinin mutlak ölçümü için geNOps önemli bir özelliğidir. NOC-7 yanıt Şekil 1, G-geNOps sinyallerin normalleşmesi gösterilen ve SNP HEK hücreleri almak için kendi kapasitesi açısından farklı olmadığını belirten aynı plakadan farklı HEK hücreleri homojen YOK • sinyallerini bildirildiği gibi ve NO • donör kaynaklı radikal YOK • bozulmasına yol açar. Bunun aksine, HeLa hücrelerinde kullanılan geNOps NOC-7 yanıt olarak farklı hücre arasında hücre NO • sinyallerinin açık bir farklılıklarını gösterdi. Bu farklılıklar, hücre fizyolojisi ve patolojisi birden etkileri olabilir ve GENOP kullanılarak ortaya edilebilir, hücre tipine özgü YOK • metabolizması ve ayrışma oranları işarets teknolojisi.

Bununla birlikte, geNOps iki önemli özelliği sensörler ve veri yorumların doğru kullanımı için özenle dikkate alınması gereken adres: i) geNOps yeterli demir gerektirir (II) tam NO • 1 yanıt vermek ve ii) FP değişkene bağlı olarak, geNOps can 1 hassas pH olacak. Burada HEK, HeLa veya EA.hy926 hücreleri (protokol 2.6) ya da ifade edilmiştir geNOps, toksik olmayan demir (II) takviyesi için uygun olduğu tespit edilmiştir, bir protokol açıklar. Demir hücre tedavisi (II) / C vitamini hücre morfolojisi, hücre canlılığı ve hücrelerin 1 metabolik aktivitesini etkilemediğini göstermiştir edilmiş olmakla beraber, başka hücre tipleri ve dokular için bu önemli bir adım optimize etmek için gerekli olabilir. Bununla birlikte, bazı deneysel koşullarda, demir (II) yükleme ihtiyacı geNOps uygulanabilirliğini kısıtlayabilir. Özellikle, askorbat N azaltabilir gösterilmiştirO • 35 ve askorbat-demir (II) kompleksleri 37, 36 • NO temizlemek mümkün. Ayrıca, aşırı demir (II) ve askorbat inflamatuar yanıtları 39 ve ayırın eNOS 41 uyarabilir. Bu tür etkiler geNOps teknolojisini kullanırken dikkat edilmesi gereken. Bazı deney koşulları altında, hücre içi pH geNOps floresan 1 etkilemek için bir potansiyele sahip olan, önemli ölçüde 34 etkilendiği gösterilmiştir. Özellikle, cam göbeği ve yeşil geNOps varyantları asitlenme 1 üzerine floresan bir azalma göstererek hassas nispeten pH vardır. pH duyarlı geNOps kullanırken Bu nedenle, (alt) hücresel pH akut değişiklikler yanlış YOK • sinyallerini simüle olabilir. Negatif contro olarak önceki çalışmaları, NO • duyarsız geNOps paralel kullanımı (geNOps mut) 'de belirtildiği gibils pH 1 değişiklikleri gerçek hücresel YOK • sinyalini incelemek için tavsiye edilir. Buna ek olarak, hücresel pH değişiklikleri gibi sypher 34 gibi pH problar kullanılarak kontrol edilebilir.

Dahası, endotel hücre yedek EA.hy926 fizyolojik Ca 2 + -mobilizing agonist yanıt olarak endojen enzimatik NO • oluşumu görünür hale getirilir. EA.hy926 hücre hattı sürekli eNOS 38 ifade eden bir sık kullanılan bir model sistemidir. Geçici EA.hy926 hücrelerinde ifade geNOps kullanımı, IP 3 Ca 2 + sinyalleri neredeyse tamamen L-NNA tarafından engellendi, bu hücre tipi, derin YOK • oluşumunu uyandırmak aracılı doğruladı. Geçici NO • sinyalleri ile Ca2 + ilişkili için, G-GENOP-eksprese eden hücreler UV uyarımlı kimyasal Ca2 + -indicator Fura-2 / AM ile yüklendi. Ca spektral ayrılması 2+ bağlı ve bağlı olmayan fura-2 fluorofenil G-GENOP sinyalinden rescence ticari olarak satılan filtresi 40 setleri ile elde edilebilir. Görüntüleme sondalar hem Ca 2 + -triggered enzimatik YOK • formasyonu bu endotel hücre tipinde sitozolik Ca 2+ artışa kıyasla çok daha yavaş gerçekleştiğini açıkladı. IP 3 üreten agonist bradikinin hücre işlenmesi üzerine sığır pulmoner arter endotel hücrelerinde tek hücreli NO • sinyallerinin benzer kinetik, hem de kesme stresleri ile bildirilmiştir NOA-1, dolaylı yüksek NO • -duyarlı sensörü 12 . Buna göre, bu veriler Ca 2 + tam enzim aktivitesi ulaşılana kadar eNOS türetilen YOK • formasyonu belli bir başlangıç süresi gerektirir -evoked vurgulamak. Hücresel YOK • oluşumu, difüzyon ve yıkımı kinetik diğer verileri elde edilebilmesine rağmen, NO • örneğin gerilim tabanlı ölçümler damar gevşeme -kaynaklıss = "xref"> 26, floresan YOK • probları büyük yararı doğrudan gerçek zamanlı olarak görünen sinyaller haline hücresel YOK • dalgalanmaları dönüştürmek olduğunu. Bu nedenle, geNOps ile görüntüleme hücresel YOK • sinyalleri yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğü sağlar ve (alt) hücresel YOK • homeostazisini soruşturma (re) eşsiz olanaklar sunmaktadır. Örneğin, görüntü eNOS tek endotel hücrelerinde geNOps teknolojisi ile kombinasyon halinde 42 mekik enzim ya da kalmodulin ve kaveolin 43 gibi diğer ilgili protein -yaratan NO • alt hücresel lokalizasyonu ve translokasyon NO • oluşumunu ilişkilendirmek için uygun olabilir.

Burada HEK ve EA.hy926 hücreleri geleneksel geniş alan floresan m üzerinde tek hücre düzeyinde ve gerçek zamanlı olarak oluşturulan hücresel YOK • sinyallerini dışsal olarak görselleştirmek ve endojen için ifade G-GENOP ve uygulanabilir bir uygulama tarificroscope. Bizim verilerimiz geNOps özellikle ilginç hücre tiplerinin her türlü kullanarak çeşitli deneysel koşullar altında (alt) hücresel YOK • dinamikleri takip etmek için uygun olduğunu göstermektedir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors acknowledge C.J. Edgell, Pathology Department, University of North Carolina at Chapel Hill, NC, USA for providing the EA.hy926 cells. Author E.E. is supported by Nikon Austria within the Nikon-Center of Excellence, Graz and is a fellow of the Ph.D. program in Molecular Medicine at the Medical University of Graz. The researchers are also supported by the Ph.D. program Metabolic and Cardiovascular Disease (DK-W1226) of the Medical University of Graz. This work was also funded by the FWF project P 28529-B27. Microscopic equipment is part of the Nikon-Center of Excellence, Graz that is supported by the Austrian infrastructure program 2013/2014, Nikon Austria Inc., and BioTechMed, Graz.

Materials

NaCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3957.20 sodium chloride
KCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6781.1 potassium chloride
CaCl2 .2H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany T885.1 calcium chloride dihydrate
MgCl2 .6H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2189.2 magnesium chloride hexahydrate
HEPES Carl Roth, Karlsruhe, Germany 9105.3 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
NaHCO3 Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8551.1 sodium hydrogencarbonate
KH2PO4 Merck, Darmstadt, Germany 104873 potassium dihydrogen phosphate
Na2HPO4 .2H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4984.1 sodium hydrogenphosphate dihydrate
D(+)-Glucose monohydrate Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6780.1 >99.5%; for cell culture, endotoxin free;
EGTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3054.2 ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid; calcium chelating agent
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6771.1 sodium hydroxide
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4625.1 hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N)
DMSO Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4720.1 dimethyl sulfoxide;  highly polar, aprotic organic solvent
L-Glutamic acid hydrochloride  Sigma Aldrich, Vienna, Austria G2128 (S)-2-Aminoglutaric acid
DMEM, low glucose Sigma Aldrich, Vienna, Austria D5523 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose; with 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture 
MEM Vitamin solution (100X) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11120037 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM)
MEM Amino acids solution (50X) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11130036 50X the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15140122.00 antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures
Amphotericin B Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15290026.00 Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi
FCS Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270106 Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin
PBS, pH 7.4 Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010031.00 phosphate-buffered saline
Fura-2 (AM) Teflabs, Austin, TX, USA 102 fluorescent cytosolic calcium indicators
Histamine dihydrochlorid Sigma Aldrich, Vienna, Austria H7250  2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist 
Nω-Nitro-L-arginine Sigma Aldrich, Vienna, Austria N5501 N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA;  inhibitor of nitric oxide synthase
NOC-7 Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany 487952 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release
Sodium nitroprusside dihydrate Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA sc-203395A sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound
30-mm Cover slips Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany 41001130 glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30-mm, (VE: 100 pcs.) 
Iron(II) booster solution Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells;  http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/
G-geNOp plasmid Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product/g-genop/
G-geNOp AAV5 Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/
G-geNOp sensor cell line Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/
HEK293A cell line Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA R70507 subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) 
EA.hy926 cell line American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany CRL-2922 somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549
TILL iMIC Till Photonics, Graefling, Germany n.a. digital microscope
Polychrome V monochromator Till Photonics, Graefling, Germany n.a. ultra fast switching
AVT Stingray F145B Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany n.a. Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b
alpha Plan Fluar 40 Zeiss, Göttingen, Germany n.a. x40 objective
dichroic filters Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA n.a. GFP emitter 514/3 nm (515dcxr)
ValveBank8 Controller AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA 01-08 programmable perfusion system control unit
BVC control Vacuubrand, Wertheim, Germany 727200 Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system
ImageJ software  NIH Image  Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eroglu, E., et al. Development of novel FP-based probes for live-cell imaging of nitric oxide dynamics. Nat Commun. 7, 10623 (2016).
  2. Bush, M., et al. The structural basis for enhancer-dependent assembly and activation of the AAA transcriptional activator NorR. Mo. Microbiol. 95 (1), 17-30 (2015).
  3. Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nat. Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
  4. D’Autréaux, B., Tucker, N., Spiro, S., Dixon, R., Poole, e. d. .. P. o. o. l. e. ,. R. .. K. .. ,. (. e. d. ). .. ,. Characterization of the Nitric Oxide-Reactive Transcriptional Activator NorR. Globins and Other Nitric Oxide-Reactive Proteins, Part B. 437, 235-251 (2008).
  5. Strack, R. Sensors and probes: Yes to genetically encoded NO• sensors. Nat Methods. 13 (4), 288 (2016).
  6. Auten, R. L. Response to ‘The use of diaminofluorescein for nitric oxide detection: Conceptual and methodological distinction between NO and nitrosation. Free Radic. Biol. Med. 50 (12), 1812 (2011).
  7. Sivaraman, G., Anand, T., Chellappa, D. A Fluorescence Switch for the Detection of Nitric Oxide and Histidine and Its Application in Live Cell Imaging. ChemPlusChem. 79 (12), 1761-1766 (2014).
  8. Ye, X., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Detection of nitric oxide in single cells. Analyst. 133 (4), 423-433 (2008).
  9. Thyagarajan, B., Malli, R., Schmidt, K., Graier, W. F., Groschner, K. Nitric oxide inhibits capacitative Ca2+ entry by suppression of mitochondrial Ca2+ handling. Br J Pharmacol. 137 (6), 821-830 (2002).
  10. Germond, A., Fujita, H., Ichimura, T., Watanabe, T. M. Design and development of genetically encoded fluorescent sensors to monitor intracellular chemical and physical parameters. Biophy. Rev. 8, 121-138 (2016).
  11. Malli, R., Eroglu, E., Waldeck-Weiermair, M., Graier, W. F. Filling a GAP-An Optimized Probe for ER Ca2+ Imaging In Vivo. Cell Chem Biol. 23 (6), 641-643 (2016).
  12. Sato, M., Hida, N., Umezawa, Y. Imaging the nanomolar range of nitric oxide with an amplifier-coupled fluorescent indicator in living cells. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (41), 14515-14520 (2005).
  13. Weidinger, A., Kozlov, A. V. Biological Activities of Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Oxidative Stress versus Signal Transduction. Biomolecules. 5 (2), 472-484 (2015).
  14. Paolo, S. Nitric Oxide in Human Health and Disease. Encyclopedia of life sciences. , (2005).
  15. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
  16. Bonafe, F., Guarnieri, C., Muscari, C. Nitric oxide regulates multiple functions and fate of adult progenitor and stem cells. J Physiol Biochem. 71 (1), 141-153 (2015).
  17. Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur. Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
  18. Dudzinski, D. M., Igarashi, J., Greif, D., Michel, T. The regulation and pharmacology of endothelial nitric oxide synthase. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 46, 235-276 (2006).
  19. Zhou, L., Zhu, D. -. Y. Neuronal nitric oxide synthase: structure, subcellular localization, regulation, and clinical implications. Nitric Oxide. 20 (4), 223-230 (2009).
  20. Aktan, F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sci. 75 (6), 639-653 (2004).
  21. Ghafourifar, P., Cadenas, E. Mitochondrial nitric oxide synthase. Trends Pharmacol Sci. 26 (4), 190-195 (2005).
  22. Crane, B. R., Sudhamsu, J., Patel, B. A. Bacterial nitric oxide synthases. Annu Rev Biochem. 79, 445-470 (2010).
  23. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
  24. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochim Biophys Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
  25. Zhang, Y., et al. Estrogen-related receptors stimulate pyruvate dehydrogenase kinase isoform 4 gene expression. J Biol Chem. 281 (52), 39897-39906 (2006).
  26. Holzmann, S., Kukovetz, W. R., Windischhofer, W., Paschke, E., Graier, W. F. Pharmacologic differentiation between endothelium-dependent relaxations sensitive and resistant to nitro-L-arginine in coronary arteries. J Cardiovasc Pharmacol. 23 (5), 747-756 (1994).
  27. Bentley, M., et al. Vesicular calcium regulates coat retention, fusogenicity, and size of pre-Golgi intermediates. Mol Biol Cell. 21 (6), 1033-1046 (2010).
  28. Ignarro, L. J. Nitric oxide: a unique endogenous signaling molecule in vascular biology. Biosci Rep. 19 (2), 51-71 (1999).
  29. Upreti, M., Kumar, S., Rath, P. C. Replacement of 198MQMDII203 of mouse IRF-1 by 197IPVEVV202 of human IRF-1 abrogates induction of IFN-β, iNOS, and COX-2 gene expression by IRF-1. Biochem Biophys Res Com. 314 (3), 737-744 (2004).
  30. Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo. J Vis Exp. (111), (2016).
  31. de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Na. Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
  32. Latchman, D. S. Transcriptional Gene Regulation in Eukaryotes. Encyclopedia of life sciences. , (2005).
  33. Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. M. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
  34. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
  35. Suarez, S. A., et al. Nitric oxide is reduced to HNO by proton-coupled nucleophilic attack by ascorbate, tyrosine, and other alcohols. A new route to HNO in biological media. J Am Chem Soc. 137 (14), 4720-4727 (2015).
  36. Kuropteva, Z. V., Kudryavtsev, M. E. Ferrous-ascorbate complexes as carriers of nitric oxide. Gen Physiol Biophys. 16 (1), 91-96 (1997).
  37. Vanin, A. F., Huisman, A., Stroes, E. S., Ruijter-Heijstek, F. C., Rabelink, T. J., van Faassen, E. E. Antioxidant capacity of mononitrosyl-iron-dithiocarbamate complexes: implications for NO trapping. Free Radic Biol Med. 30 (8), 813-824 (2001).
  38. Lindberg, R. A., Dewhirst, M. W., Buckley, B. J., Hughes, C. S., Whorton, A. R. Ca2+-dependent nitric oxide release in endothelial but not R3230Ac rat mammary adenocarcinoma cells. Am J Physiol. 271 (1), 332-337 (1996).
  39. Campo, G. M., et al. The SOD mimic MnTM-2-PyP(5+) reduces hyaluronan degradation-induced inflammation in mouse articular chondrocytes stimulated with Fe (II) plus ascorbate. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1610-1619 (2013).
  40. Waldeck-Weiermair, M., et al. Spatiotemporal correlations between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signals using a novel red-shifted mitochondrial targeted cameleon. PLOS ONE. 7 (9), 45917 (2012).
  41. Kuzkaya, N., Weissmann, N., Harrison, D. G., Dikalov, S. Interactions of peroxynitrite with uric acid in the presence of ascorbate and thiols: implications for uncoupling endothelial nitric oxide synthase. Biochem Pharmacol. 70 (3), 343-354 (2005).
  42. Liu, J., Hughes, T. E., Sessa, W. C. The first 35 amino acids and fatty acylation sites determine the molecular targeting of endothelial nitric oxide synthase into the Golgi region of cells: a green fluorescent protein study. J Cell Biol. 137 (7), 1525-1535 (1997).
  43. Feron, O. The Endothelial Nitric-oxide Synthase-Caveolin Regulatory Cycle. J Biol Chem. 273 (6), 3125-3128 (1998).

Tags

Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide ProbesGeNOpsReal-time ImagingNitric Oxide SignalsSingle CellsFluorescence MicroscopeIron(II) Booster SolutionFura-2AMPerfusion ChamberGravity-driven PerfusionPhysiological Calcium Buffer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Eroglu, E., Rost, R., Bischof, H., Blass, S., Schreilechner, A., Gottschalk, B., Depaoli, M. R., Klec, C., Charoensin, S., Madreiter-Sokolowski, C. T., Ramadani, J., Waldeck-Weiermair, M., Graier, W. F., Malli, R. Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO•) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO• Signals in Single Cells. J. Vis. Exp. (121), e55486, doi:10.3791/55486 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image