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Biology

Aplicación de la codificados genéticamente fluorescente óxido nítrico (NO •) Probes, los geNOps, para imágenes en tiempo real de NO • Las señales en las células individuales

Published: March 16, 2017
doi:
10.3791/55486
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1Institute of Molecular Biology and Biochemistry,Medical University of Graz

Summary

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO•) probes (geNOps) to monitor single cell NO• fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO• formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

Abstract

El óxido nítrico (NO •) es un pequeño radical, que media varias funciones celulares importantes en mamíferos, bacterias y plantas. A pesar de la existencia de un gran número de métodos para la detección de NO • in vivo e in vitro, la monitorización en tiempo real de NO • a nivel de células individuales es muy difícil. Los efectos fisiológicos o patológicos de NO • están determinadas por la concentración real y tiempo de permanencia de este radical. En consecuencia, los métodos que permiten la detección de una sola célula de NO • son altamente deseables. Recientemente, hemos ampliado la paleta de NO • indicadores mediante la introducción de óxido de un solo fluorescente basada en la proteína codificada genéticamente sondas nítrico (NO •) (geNOps) que responden directamente a las fluctuaciones celulares NO • y, por lo tanto, se dirige a esta necesidad. Aquí se demuestra el uso de geNOps para evaluar intracelulares NO • señales en respuesta a dos química diferente NO • moléculas -liberating. Nuestros resultados del also confirman que recién preparada 3- (2-hidroxi-1-metil-2-nitrosohydrazino) -N-metil-1-propanamina (NOC-7) tiene un potencial mucho más alto para evocar el cambio en intracelulares NO • niveles en comparación con el inorgánica • NO nitroprusiato de sodio donante (SNP). Por otra parte, de dos colores imágenes de células vivas utilizando los geNOps verdes (G-GENOP) y el indicador químico de Ca2 + fura-2 se realizó para visualizar la regulación estricta de Ca 2 + dependientes de NO • formación en las células endoteliales individuales. Estos experimentos demuestran que geNOps representativos son herramientas adecuadas para investigar la generación en tiempo real y la degradación de una sola célula de NO • señales en diversos montajes experimentales.

Introduction

Recientemente, hemos desarrollado una nueva clase de fluorescentes • NO sondas codificados genéticamente, llamado los geNOps 1. Estos sensores consisten en una simple construcción, derivados de bacterias, NO • dominio de unión 2, que está conjugado a una proteína fluorescente diferente (FP) variante 3 (cian, verde o naranja FP). • NO se une al núcleo de hierro no hemo (II) 4 dentro de los geNOps reduce instantáneamente la intensidad de fluorescencia 1. Es importante destacar que la fluorescencia geNOps recupera rápida y completamente cuando intracelulares NO • 1 niveles disminuyen. En consecuencia, geNOps permiten imágenes en tiempo real de los (sub) celulares NO • fluctuaciones. Aunque el mecanismo de NO • detección de geNOps siguen sin estar claros hasta ahora, han demostrado ser excelentes NO • reporteros, y por lo tanto tienen la potencia para abrir una nueva era de policromática, cuantitativa NO • bioimaging con una alta resolución espacial y temporal 1, 5. Otros disponible fluorescentes NO • sondas se basan en compuestos químicos pequeños, que necesitan ser cargados en las células, y están irreversiblemente modificados por NO • 6. Otras desventajas de NO • pequeñas fluoróforos sensibles son su potencial citotoxicidad y especificidad relativamente baja, que hacen que sea difícil de usar de una manera fiable, de análisis y concluyente 7, 8, 9. Aunque el uso eficaz de sondas fluorescentes codificadas genéticamente requiere técnicas de transferencia génica eficaz, sensores codificados genéticamente basados en FP se han convertido en herramientas indispensables que han revolucionado nuestra comprensión del funcionamiento interno de las células 10, 11. Antes del desarrollo de los geNOps individuales basados ​​en FP, un Förster transferencia de energía de resonancia (FRET) a base de NO • sensor, referido como NOA-1 12, se construyó. Sato et al. diseñó esta sonda sofisticado que consiste en dos subunidades de la NO • -sensible guanilato ciclasa soluble (sGC), ambos conjugados sensores basados en FRET a informes de guanosina monofosfato cíclico (GMPc) 12 niveles. Como esta sonda responde a GMPc, que sólo indirectamente detecta intracelulares NO • fluctuaciones 12. Aunque NOA-1 responde a NO • elevaciones en el rango nano-molar, esta herramienta no se ha utilizado con frecuencia hasta ahora, probablemente debido a las limitaciones en cuanto a la disponibilidad y viabilidad de este sensor bipartita voluminosos.

Funciones versátiles de NO •, que impacto fundamental procesos biológicos se han caracterizado bien 13, 14. Muchos estudios han demostrado que el NO • concentration dentro de las células y subdominios determina el destino celular en la salud y enfermedades 14, 15, 16. En los mamíferos, NO • es principalmente generado enzimáticamente en varios tipos de células de la familia bien caracterizado óxido nítrico sintasa (NOS) 17. Hasta el momento, tres isoformas de NOS se han descrito 18, 19, 20; estos son el Ca 2 + endotelial / calmodulina dependiente de la NOS (eNOS o NOS-3) 18 y la NOS neuronal (nNOS o NOS-1) 19, y el Ca 2 + / calmodulina independiente constitutivamente activa NOS inducible (iNOS o NOS- 2) 20. Por otra parte, la existencia de mitocondrial NOS (mtNOS) También se ha sugerido 21. Sin embargo, mtNOS se considera como una variante de empalme de nNOS, y por lo tanto no está clasificado por separado como una isoforma 21. Otra isoforma, aparte de los de las células de mamífero, es el llamado NOS bacteriana (bNOS), que se encuentra principalmente en bacterias gram-positivas 22. La producción enzimática de NO • es altamente controlada y depende de la disponibilidad de varios cofactores tales como nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH), flavina adenina dinucleótido (FAD), tetrahidrobiopterina (BH4), oxígeno molecular y L-arginina 17. La catiónico aminoácido L-arginina es el sustrato que se convierte en L-citrulina en NO • producción 17. Además de la generación enzimática altamente regulado de NO •, se ha postulado que el radical se puede reducir no enzimáticamente a partir de mezclas de nitrito por las mitocondrias en condiciones de hipoxia 23. Una vez NO • se produce dentro de una célula, se puede difundir libremente a través de las biomembranas 14,ref "> 15. Sin embargo, la media muy corta vida de este radical está determinada principalmente por las condiciones ambientales, y las diversas vías y reacciones químicas se degradan de manera eficiente NO • Los niveles de 24. Con el tiempo, la formación, la difusión y la degradación de NO • depende en diversos parámetros ambientales que determinar la concentración efectiva de la molécula altamente biológicamente activo 24.

La tecnología geNOps permite la detección directa de (sub) celular NO • fluctuación 1 y por lo tanto es adecuado para volver a investigar, y recientemente descubrir los mecanismos responsables de la acumulación y descomposición de celulares NO • señales. A continuación, ofrecemos protocolos sencillos y resultados representativos para el uso de geNOps de visualizar de forma exógena evocado y perfiles • NO generados de forma endógena, en el nivel de células individuales. Además, la tecnología geNOps puede ser adaptado para applicatura en otros sistemas modelo celular para el estudio de los complejos patrones de NO • formación, difusión y degradación en respuesta a diversos estímulos celulares y tensiones.

Protocol

1. Preparación de tampones y soluciones químicas Preparar un tampón de almacenamiento que contiene NaCl 135 mM, KCl 5 mM, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 2,6 mM de NaHCO3, 0,44 mM KH 2 PO 4, 0,34 mM Na 2 HPO 4, mM D- 10 glucosa, 2 mM L-glutamina, vitaminas MEM 1x, 1x MEM ácidos aminados, 1% strep pluma, y ​​1% de anfotericina B. Disolver todos los componentes en agua destilada y agitar el tampón durante 20 minutos usando un agitador magnético a temperatura ambiente. Ajustar el pH a 7,44 con NaOH 1 M. Después de la adición gota a gota de NaOH, medir el pH con un medidor de pH mientras se agita continuamente. Preparar un tampón de Ca 2 + que contienen fisiológico que consiste en NaCl 140 mM, KCl 5 mM, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glucosa, y HEPES 10 mM. Ajustar el pH a 7,4 usando NaOH como se describe en el paso 1.1. Preparar un tampón libre de Ca 2 + que consiste en los mismos ingredientescomo se indica en el paso 1.2. Utilice EGTA 1 mM en vez de 2 mM. Solubilizar Fura-2AM en DMSO para obtener una solución madre de 1 mM. Alícuota de la solución madre en frascos herméticamente cerrados y se almacena a -20 ° C durante un máximo de un mes. Si se congela, deje que la solución madre se equilibre a temperatura ambiente durante al menos 1 hora protegido de la luz. Diluir la solución madre de Fura-2AM en 1 ml tampón de almacenamiento (paso 1.1) para obtener una concentración final de 3,3 mM. Preparar 1 ml de una solución de histamina de stock 100 mM en agua destilada (pH 7,0). Diluir la solución de histamina de stock 100 mM en 100 ml Ca 2 + que contienen tampón fisiológico a una concentración final de 100 mM de histamina. Solubilizar Nω-nitro-L-arginina (L-NNA) en 100 ml de tampón fisiológico que contiene calcio para obtener una concentración final de 300 mM. Almacenar las soluciones a 37 ° C baño de agua durante al menos 1 hora hasta que la L-NNA se disuelva por completo. Solubilizar 10 mg NOC-7 en wa destiladater (pH 7,0) para obtener una solución madre 10 mM. Alícuota de la solución madre en pequeñas alícuotas en viales herméticamente cerrado y de inmediato a -70 ° C. Diluir la solución madre NOC-7 en un tampón fisiológico para obtener una concentración final de 10 mM NOC-7. NOTA: NOC-7 es un compuesto químico pequeño que libera espontáneamente NO con una vida media corta. Siempre preparar los tampones de trabajo que consiste NOC-7 justo antes de cada experimento. Hacer una solución 1 mM nitroprusiato de sodio (SNP) en un tampón de calcio fisiológico y preparar una dilución de 10 mM. NOTA: Siempre preparar pequeñas cantidades (~ 10 ml) de soluciones de donador de NO, debido a la tasa de degradación rápida. Preparar una solución de fosfato tamponada (PBS) que consiste en NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 9,2 mM Na 2 HPO 4, y 1,5 mM KH 2 PO 4. Ajustar el valor del pH a 7,44 con NaOH / HCl. 2. Preparación de la célula NOTA: En Order para lograr uniformidad en el rendimiento de la medición de óxido nítrico (NO •) en células individuales utilizando geNOps, las células tienen que ser pre-incubadas con un hierro (II) / vitamina C que contiene tampón antes de los experimentos de formación de imágenes con el fin de restaurar Fe 2+ dentro del NO • unión a dominio del NO • -probes. En el caso de las células HEK293 y EA.hy926, la incubación durante 20 minutos con la solución de refuerzo de hierro (II) conduce a la plena activación de los sensores • NO. Sembrar 5,5 x 10 5 células HEK293 EA.hy926 o para el día siguiente o 3,5 x 10 5 células para el día después del día siguiente, el cubreobjetos de microscopio de 30 mm en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Se incuban las células a 37 ° C en un ambiente humidificado con 5% de CO 2. NOTA: La información detallada con respecto a la infección viral de las células de mamíferos y construcción virus ha sido descrito por Zhang et al. 25. Este paso no se aplica para las células HEK 293 que expresan de forma estable G-GENOP. Tome suero fetal de ternera (FCS) y Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) libre de antibióticos y añadir adeno-asociado virus de tipo 5 vector (AAV5) que lleva el gen que codifica para G-GENOP (MOI: 500 para las células EA.hy926 rendimiento casi 100 % de células positivas; MOI: 1 es eficiente para las células HEK293). NOTA: El uso de vectores virales adeno-asociado se le asigna al grupo de riesgo en general, se requiere 2. Bioseguridad Nivel 2 de contención para el trabajo con este vector. Si es necesario, la infección por virus también se puede realizar en FCS que contienen medio. Alternativamente, las células pueden ser transfectadas transitoriamente utilizando portadores basados en lípidos 1. Retire el medio de cultivo y lavar las células con pre-calentado (37 ° C) de PBS. Añadir 1 ml de medio DMEM / AAV5 en cada pocillo durante 1 hr. Este paso no se aplica para las células HEK 293 que expresan de forma estable G-GENOP. Añadir 1 ml de 20% de FCS que contiene DMEM en cada pocillo a una concentración final de 10% de FCS. No retire los medios de AAV5 que contiene de las células. CaballeroLy sube y baja la placa de homogeneizar el medio dentro de los pozos. Se incuban las células durante 48 horas a 37 ° C en un ambiente humidificado con 5% de CO 2. Este paso no se aplica a las células HEK 293 que expresan de forma estable G-GENOP. Después de 48 horas, lavar las células con PBS precalentado. Posteriormente se añaden 2 ml de pre-calentado tampón de almacenamiento (punto 1.1) a cada pocillo e incubar las células en el sitio de la temperatura ambiente durante al menos 1 hora protegido de la radiación de luz. Reemplazar el tampón de almacenamiento con 1 ml / pocillo de la solución de refuerzo de hierro (II) a temperatura ambiente (RT). Se incuban las células durante exactamente 20 min en la oscuridad. NOTA: No superar o reducir el tiempo óptimo de incubación ya que esto podría afectar a la capacidad de respuesta de las sondas • NO. Lavar las células una vez con tampón de almacenamiento y se incuba cada pocillo con tampón de almacenamiento de 2 ml durante al menos 2 horas a RT con el fin de permitir que las células se equilibren. Reemplazar el tampón de almacenamiento con 3,3 M Fura-2AM en tampón de almacenamiento 1 ml durante 45 minutos a RT, protegidode la luz. Lavar las células dos veces con tampón de almacenamiento y se incuba, una vez más durante al menos 30 min con el fin de permitir que las células se equilibren. 3. Imágenes de células vivas de NO • y Ca 2 + señales en las células individuales Fijar una hoja de cubierta 30 mm revestido con células HEK293 o EAhy.926 (desde el paso 2.1) en una cámara de perfusión de metal y colocarlo en el microscopio. Conectar el tubo de afluencia a los depósitos tampón y el flujo de salida a una bomba de vacío. Asegurar un flujo constante y evitar que se descargue de la hoja de la cubierta. Iniciar la perfusión por gravedad con tampón de calcio fisiológico (de la etapa 1.2), utilizando un sistema de perfusión semi-automática. NOTA: Tal sistema consiste en depósitos de tampón, la tubería respectiva, válvulas magnéticas que se controlan electrónicamente y una bomba de vacío (véase la Figura 1B). La velocidad de flujo puede variar de 1 a 3 ml / min, dependiendo de la altura de los depósitos de perfusión. Para apli droga locales consistentescatiónico, la velocidad de flujo de todos los depósitos utilizados debe ser aproximadamente igual. Esto debe ser probado antes de los experimentos de imagen. Considere que las células endoteliales responden a un aumento de la tensión de cizallamiento que puede ser inducida por perfusión riguroso. Encienda el sistema de imagen y dejar que se caliente de todos los dispositivos durante 30 minutos. Definir la configuración de imagen utilizando el software respectivo. Seleccionar de excitación de longitud de onda 340 nm y 380 nm para fura-2 de formación de imágenes y 480 nm para la excitación de G-GENOP. Para minimizar la decoloración de fluorescencia aumentar el binning cámara a 4 y reducir las intensidades de excitación y tiempos de exposición. Ver también los pasos 3.6 a 3.8. NOTA: Los ajustes de imagen y parámetros dependen de los dispositivos utilizados, fura-2 eficiencia de carga y los niveles de expresión de G-GENOP. Seleccione la región de imagen moviendo el xyz-mesa del microscopio hasta varias células fluorescentes están en el foco. A continuación, definir regiones de interés (ROI) a través de la herramienta de software respectivo. Dibujar regiones que abarcan varios cabeza del c enterae células fluorescentes por campo de la imagen manualmente. Además, definir una región de fondo de tamaño similar. NOTA: una vez que las imágenes han sido adquiridos y almacenados ROIs también se puede definir nuevamente después del proceso de formación de imágenes para su posterior análisis usando software de análisis de imágenes respectiva (ver Lista de Materiales). Comience a recoger datos en un microscopio de fluorescencia invertido y avanzada con una etapa de la muestra motorizada, y una fuente de luz monocromática. Alternativamente excitar a 340 nm y 380 nm para Fura-2AM y 480 nm para G-GENOP, respectivamente. Establecer tiempos de exposición respectivos de modo que para todos los canales, una señal de fluorescencia clara es detectable en el tiempo. Véase también el paso 3.4. NOTA: Esto depende de la intensidad de la luz de excitación y el binning cámara. Por ejemplo, utilizar el 15% de intensidad de la luz de excitación, una cámara de intervalos de 4 y 150 ms para 340 nm, 50 ms para 380 nm y 300 ms para 480 nm. Véase también el paso 3.4. Recoge la luz emitida a 510 nm para fura-2 / AM, 520 nm para el G-genop usando un dispositivo de cámara de carga acoplada (CCD) con el correspondiente juego de filtros que consiste en el excitador 500 nm, un dicroico de 495 nm y 510-520 nm emisor. Grabar un total de cuadros de cada 3 s. Registrar los primeros minutos (si es necesario hasta 3 min) en tampón fisiológico de Ca2 + (1,2) para obtener la línea de base de las señales de fluorescencia en el tiempo respectivos. Una vez que se observa una fluorescencia de línea de base estable, cambiar a 100 histamina M o ATP (1 mM o 100 mM) que contiene tampón fisiológico Ca 2+ para estimular las células para 3 min. NOTA: Las células EA.hy926 que responden a los agonistas muestran un fuerte aumento de la proporción de fura-2 (fluorescencia excitada a 340 nm dividida por la fluorescencia excitada a 380 nm) y una clara disminución de la señal de fluorescencia G-GENOP. Cambie de nuevo a la fisiológica tampón de Ca2 + y sin histamina o ATP y L-NNA durante 5 minutos para eliminar los compuestos de las células. Este paso podría prolongarse hasta los FLUORESCENTECence cambios se recuperan por completo. Administrar 10 M NOC-7 en tampón fisiológico Ca 2+ durante 2 minutos usando el sistema de perfusión. El donante de NO afecta fuertemente G-GENOP fluorescencia que generalmente disminuye en> 20% en respuesta a 10 mM NOC-7. En las células EA.hy926 el efecto NOC-7 es aproximadamente 3 veces más fuerte en comparación con el agonista inducida G-GENOP fluorescencia de enfriamiento. Lavar el compuesto liberador de NO • durante aproximadamente 10 minutos con Ca 2+ fisiológica tampón y detener la grabación una vez que se recupera la fluorescencia basal. Análisis 4. Datos Exportación adquirió datos de intensidad media de fluorescencia de las células individuales en el tiempo, para el software de análisis de datos. Restar respectivos valores de fondo y calcular la relación de 340 nm por 380 nm de los respectivos Fura-2 señales de cada célula individual con el tiempo. Restar los valores de fondo del canal G-GENOP para obtener la corriente realfluorescencia intensidad de la sonda NO (F) con el tiempo el uso de cualquier software de cálculo. Tomar los valores de fluorescencia de línea de base como F 0 (F 0 es la fluorescencia de la sonda de NO en el tiempo sin estimulación). Ver también la etapa 4.5 y la Figura 1C. Calcula una función en el tiempo para los efectos de blanqueo de fluorescencia utilizando la siguiente ecuación: F = F 0 inital • exp (-K • Tiempo) + F meseta. F inital: se inicia la señal de fluorescencia máxima de imagen una vez; K: constante de velocidad de la decoloración de fluorescencia con el tiempo; F meseta: un mínimo de fluorescencia alcanzado por la decoloración con el tiempo; Ver también los pasos 4.3- 4.4 y la Figura 1C. NOTA: Para la aproximación, todos los valores de fluorescencia con el tiempo antes y después de la estimulación de células pueden ser utilizadas. Más detalles son especificados por Bentley et al. 27. Para normalizar la señal del G-GENOP con el tiempo, calcule 1-F / F0 (pasos 4.3-4.5). Ver la Figura 1C y 1D.

Representative Results

La visualización de una sola célula NO • Perfiles en respuesta a Transitoriamente Aplicada donadores de NO Se utilizó un clon de células HEK que expresa de forma estable G-GENOP (Figura 1A), con el fin de visualizar NO • señales en el único nivel celular en respuesta a dos compuestos químicos pequeños NO-liberar diferentes, NOC-7 y SNP. Los donantes • NO se aplicaron de forma consecutiva o eliminarse de las células durante la obtención de imágenes mediante un sistema de perfusión por gravedad que aseguró flujo continuo (Figura 1B). Todas las células que expresan G-GENOP con diferentes intensidades mostraron una clara reducción de la fluorescencia en respuesta a NOC-7 y SNP (Figura 1C), lo que indica rápida acumulación de NO • dentro de las células tras la adición de los NO • donantes. Señales de fluorescencia normalizada (1-F / F 0) demostraron que el NO • donantes evocados cellula homogénear • NO elevaciones que se recuperó por completo al lavado de los compuestos NO • liberador (Figura 1D). Sin embargo, SNP 10 M indujo sólo el 50% de la señal celular • NO (9,63 ± 1,05%, n = 3/38) que fue alcanzado por 10 M NOC-7 (18.10 ± 1.20%, n = 3/38, p < 0,0001). Con el fin de lograr la igualdad intracelulares NO • niveles con el NO • donantes, se requiere una concentración de 1 mM de SNP (figuras 1C, 1D). A continuación, probamos la capacidad de los recién preparada frente expirado NOC-7 para elevar los niveles intracelulares NO • en las células HEK. Con este fin, hemos preparado cuatro tampones experimentales que contienen 5 mM NOC-7. El NO • donantes se añadió ya sea recién justo antes de la medición, o se mantiene dentro de los depósitos para 1 hr, 2 hr y 3 hr a temperatura ambiente antes de la medición. Los diferentes tampones se aplicaron consecutivamente a y f eliminanesde las células que expresan G-GENOP utilizando un sistema de perfusión (Figura 2B). Este enfoque dio a conocer la estabilidad del acuosas NOC-7 soluciones que, como se esperaba, mostraron una disminución de la capacidad con el tiempo para elevar los niveles intracelulares NO • (Figuras 2A, 2C). Curiosamente, NO • señales recuperaron significativamente más rápido en la eliminación de los buffers caducados, en comparación con el intracelular NO • respuesta que fue evocado por fresco NOC-7 (Figura 2C), indicando quizás adhesión de las moléculas intactas NO • -liberating en componentes celulares . La visualización simultánea de Ca2 + y NO • Las señales en las células endoteliales individuales Con el fin de estudiar Ca 2+ -Accionados NO • formación en las células endoteliales, la endotelial inmortalizada de células-sustituto de uso común, línea celular EA.hy926, era transiently transfectadas con G-GENOP y cargado con Fura-2 / AM (véase el Protocolo 2.8). La transfección produjo aproximadamente 10% de las células endoteliales positivas G-GENOP (n = 6, la Figura 3A), que es suficiente para grabar Ca 2+ -evoked NO • producción en el nivel de las células endoteliales individuales. Sin embargo, se logró casi el 100% de células positivas EA.hy926 G-GENOP utilizando un vector viral adeno-asociado (n = 6; véase el Protocolo 2.2). Antes de las mediciones de múltiples canales, se incubaron las células durante 20 min a temperatura ambiente en tampón de almacenamiento que consiste en L-NNA, un potente inhibidor irreversible NOS-26. Las células de control se mantuvieron en el mismo tampón de almacenamiento sin L-NNA (véase el Protocolo 1.1) (Figura 3B). El tratamiento de células de control con la histamina, un potente inositol 1,4,5-trifosfato (IP 3) Generando agonista, al instante elevado citosólica de Ca 2 + niveles seguido de un aumento gradual de intracelular NO • hasta que el agonista fue removed (Figuras 3C, 3D). Las células pre-tratadas con el inhibidor de NOS-mostraron señales citosólicas similares de Ca2 +, mientras que el nivel intracelular • NO se mantuvo prácticamente sin verse afectados en respuesta a la histamina (Figura 3E). EA.hy926 células que expresan G-GENOP también fueron tratados con 1 M y 100 M del IP3 Generando ATP agonista con el fin de probar si o no geNOps son apropiados para vigilar NO • señales en respuesta a la baja tanto fisiológica y supra-fisiológica concentraciones de un agonista (Figura 3F). En la línea celular endotelial 1 mM ATP evocado una clara citosólica NO • señal, que era aproximadamente la mitad de la señal obtenida por 100 ATP mu M (Figura 3F). Figura 1: Perfiles NO intracelular en respuesta a diferentes NO-liberati ng de moléculas. (A) Imágenes de gran campo de células HEK que expresan establemente citosólica G-GENOP. Barra de escala = 20 micras. (B) Ilustración esquemática de un sistema de perfusión gravedad basado media-automática para la aplicación controlada y eliminación de NOC-7 y SNP. La intensidad de fluorescencia de una sola célula (C) Representante (de un total de 3 experimentos independientes) no normalizada traza en unidades arbitrarias en función del tiempo de las células HEK que expresan establemente citosólica G-GENOP en respuesta a 10 mM SNP NOC-7, 10 mM y 1 mM SNP. Negro curva en negrita representa la curva promedio de 26 huellas de una sola célula (ligeras curvas grises). Punteado curva negro representa F 0, que se utilizó para la normalización. (D) las huellas individuales normalizados y invertidas (1-F / F 0, curvas de color gris claro), y la media de la curva (negro curva en negrita) con el tiempo en respuesta a 10 mM NOC-7, 10 mM SNP y SNP 1 mM extrae de el panel C.en / ftp_upload / 55486 / 55486fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Ensayo de estabilidad del NOC-7 utilizando células HEK estable G-GENOP expresan. (A) Representante NO • curva de respuesta a la concentración con el tiempo de manera estable G-GeNOps que expresan las células HEK tras la aplicación de NOC-7 soluciones tampón nuevo y antiguo. Todos los tampones contienen NOC-7 se prepararon inicialmente con una concentración final de 5 mM utilizando la misma solución madre (50 mM). El tiempo transcurrido de las soluciones respectivas después de la preparación hasta cantidades de formación de imágenes a 1 hr, 2 hr y 3 hr, como se indica. (B) Representación esquemática de un sistema de perfusión de medio automático basado gravedad para añadir y eliminar consecutivamente soluciones que contienen NOC-7 durante la exploración. (C) correlaciones temporales de• NO celular en respuesta a las señales viejas NOC-7 tampones recién preparados y. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: imágenes multicanal simultánea de NO • y Ca 2 + señales en las células individuales EA.hy926. (A) las imágenes de fluorescencia de campo amplio representativos de células que expresan EAhy.926 G-GENOP (panel izquierdo) que se cargan con fura-2 / AM (central y paneles de la derecha). Barra de escala = 20 micras. (B) Ilustración esquemática del tratamiento de las células con 500 EAhy.926 M Nω-nitro-L-arginina (L-NNA) durante 20 minutos dentro de una placa de seis pocillos antes de la medición. (C) curso temporal Representante de un registro simultáneo de fura-2 (excitación: 340 nm / 380 nm emission: 510 nm) y las señales de G-GENOP (excitación: 480 nm; emisión: 520 nm) en respuesta a la histamina 100 mM. Como se eliminó la histamina se indica después de 3 min usando un sistema de perfusión. (Línea de Fura-2 señales de formato, F 340 / F 380 es de color gris sólido) (D) Las curvas representan grabaciones simultáneas de citosólica de Ca2 + y NO • (curva normalizada e invertida, 1-F / F 0 es verde línea continua) señales con el tiempo de un único fura-2 / aM cargado de células endoteliales que expresan transitoriamente G-GENOP. Las células se estimularon con la histamina 100 M durante 3 min en una Ca 2 + (2 mM CaCl 2) que contiene tampón (n = 8/3). (E) Representante de forma simultánea registró Ca 2+ (línea gris) y NO • (línea continua verde) las señales a través del tiempo de una célula EA.hy926 que se trató previamente con 500 mM Nω-nitro-L-arginina (L-NNA) antes a medida (n = 12/3). Las células fueron tratadas con 100 mM de histamina en presencia de 2 mMCa 2+. (F) curvas que representan Promedio citosólicas NO • señales en respuesta a ATP 1 mM, seguido de una segunda estimulación de células con 100 ATP M. Las barras representan valores medios ± SD de señales máximas G-GENOP en respuesta a ATP 1 mM (barra blanca) y ATP 100 mM (barra verde) de 4 experimentos independientes; p <0,001 frente a 1 mM ATP. P-valor se calculó utilizando una prueba t no pareada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Desde el descubrimiento de NO • como una molécula de señalización importante en la biología 28, la medición en tiempo real específica del radical en las células individuales, tejidos y animales enteros con alta resolución de una manera factible y fiable ha sido aspirado. Aquí se presenta la aplicación del recientemente desarrollados fluorescentes • NO sondas codificados genéticamente (geNOps) que permiten exacta imágenes de células vivas de NO • señales usando en todo el campo de la microscopía de fluorescencia 1.

Para eludir los procedimientos de transfección elaborados e invasivos clon de células HEK que expresa de forma estable fluorescente verde G-GENOP se utilizó para cuantificar unicelulares generados exógenamente NO • perfiles. Como las células HEK normalmente no producen NO • endógenamente 29, este tipo de células es adecuado para la generación de una línea celular de sensor basado en GENOP, lo que podría ser útil para muchas otras aplicaciones en las condiciones de co-cultivocon el NO • producción de células primarias o incluso en los animales que viven 30. Sin embargo, en este estudio hemos demostrado la capacidad de varios compuestos NO • -liberating, de diferentes concentraciones y estabilidades, para evocar intracelulares NO • señales utilizando el modelo de células HEK-G GENOP expresar. Nuestros datos revelaron que el NO • -donor concentración, la calidad y el método de aplicación, finalmente determinan los patrones de NO intracelulares • perfiles. Dicha información es indispensable para la caracterización farmacocinética in situ de los diferentes NO • donantes, que son indicativos de varias enfermedades. Notablemente, geNOps han demostrado responder de forma estable a múltiples aplicaciones repetitivas de NO • -donor impulsos durante un tiempo muy largo 1. En consecuencia, los experimentos que usan NO • -liberating compuestos presentados en este documento, permiten extraer conclusiones semi-cuantitativos con respecto a las diferentes amplitudes y cinética de la respectiva NO celular226; señales (Figuras 1 y 2).

Aunque el clon de células HEK que expresan establemente probablemente se origina a partir de una sola célula, una amplia heterogeneidad de G-geNOps niveles de expresión se observó (Figura 1). Esta es una característica común de clones celulares estables como la transcripción del gen (genoma integrado) de interés está bajo el control de muchos factores, tales como diversas tensiones ambientales 31 que influyen en las tasas de crecimiento de células 32, y el estado del ciclo celular 33. Los geNOps individuales basados en FP son sondas no radiométricos y, por lo tanto, el NO • pérdida de intensidad de fluorescencia aumenta con el nivel de expresión GENOP 1 inducida. En consecuencia, la normalización de las señales geNOps es esencial para cuantificar celulares NO • Señales particularmente en el caso de un análisis comparativo. Como se muestra en nuestro estudio reciente, una correlación lineal estricta bntre la intensidad de fluorescencia basal de geNOps y la fuerza de la extinción de la fluorescencia inducida por NO • en un amplio intervalo de intensidades de fluorescencia se ha encontrado 1. Esta es una característica importante de geNOps para la cuantificación absoluta de celulares NO • señales. Como se muestra en la Figura 1, la normalización de las señales G-geNOps en respuesta a NOC-7 y SNP reveló homogéneos NO • señales en diferentes células HEK del mismo plato, lo que indica que las células HEK no son diversos en cuanto a su capacidad para asumir y degradar el radical NO • que se origina desde el NO • donantes. Por el contrario, utilizando geNOps en células HeLa demostraron heterogeneidades claras de celulares NO • señales entre las diferentes células en respuesta a NOC-7. Estas diferencias apuntar a tipos específicos de NO • metabolismo y descomposición velocidades de células, lo que podría tener varias implicaciones en la fisiología celular y patología, y puede ser descubierto mediante el GENOPLa tecnología s.

Sin embargo, dos características importantes de geNOps tienen que ser considerados cuidadosamente para el uso correcto de los sensores y de la interpretación de datos: i) geNOps requieren adecuada de hierro (II) para responder plenamente a NO • 1 y ii) dependiendo de la variante de FP, geNOps puede ser sensible al pH 1. Aquí se describe un protocolo que se ha encontrado que es adecuado para la administración de suplementos de hierro no tóxico (II) de geNOps, que se expresan en cualquiera de HEK, HeLa o células EA.hy926 (véase el Protocolo 2.6). Si bien se ha demostrado que el tratamiento de células con hierro (II) / vitamina C no afectó la morfología celular, la viabilidad celular y la actividad metabólica de las células 1, podría ser esencial para optimizar este paso importante para otros tipos de células y tejidos. Sin embargo, en algunas condiciones experimentales, el requisito de hierro de carga (II) puede limitar la aplicabilidad de geNOps. En particular, se ha demostrado que el ascorbato puede reducir NO • 35 y ascorbato de hierro (II) son capaces de limpiar • NO 36, 37. Por otra parte, el exceso de hierro (II) y el ascorbato pueden inducir respuestas inflamatorias 39 y eNOS desacoplar 41. Tales efectos deben tenerse en cuenta cuando se utiliza la tecnología de geNOps. Se ha demostrado que bajo ciertas condiciones experimentales, el pH intracelular se ve afectada significativamente 34, que tiene el potencial de influir en el geNOps fluorescencia 1. En particular, las variantes de cian y geNOps verdes son relativamente sensibles al pH que muestra una disminución de la fluorescencia tras la acidificación 1. Por lo tanto, los cambios agudos de la (sub) pH celular pueden simular NO • señales falsas cuando se utilizan los geNOps sensibles al pH. Como se sugiere en nuestro trabajo anterior, el uso paralelo de NO • geNOps insensibles (geNOps mut) como contro negativoSe recomienda ls para diseccionar verdadera celular NO • señal del pH cambia 1. Además los cambios de pH celular pueden ser inspeccionados usando sondas de pH, tales como sypher 34.

Además, visualizamos la enzimática NO • formación endógena en respuesta a una fisiológica Ca 2+, movilizando a agonista en la célula endotelial EA.hy926 sustituto. La línea celular EA.hy926 es un sistema modelo utilizado con frecuencia expresan consistentemente eNOS 38. El uso de geNOps transitoriamente expresados en células EA.hy926, confirmó que IP3 mediada por señales de Ca 2+ evocan profunda NO • formación en este tipo de células, que fue casi completamente bloqueado por la L-NNA. Con el fin de correlacionar temporalmente Ca 2+ con NO • señales, las células G-GENOP que expresan fueron cargados con la UV-excitables química Ca2 + -indicador fura-2 / AM. La separación espectral del Ca 2+ consolidadas y no consolidadas fura-2 fluo cencia de la señal de G-GENOP se puede conseguir fácilmente con filtro comercialmente disponible fija 40. Imaging ambas sondas revelaron que el Ca 2+ enzimática -Accionados NO • formación se produce mucho más lento en comparación con el aumento del Ca2 + citosólico en este tipo de células endoteliales. Cinética similar de una sola célula de NO • Las señales en las células endoteliales de arteria pulmonar bovina por tratamiento de células con el agonista de la bradiquinina IP3 Generando, así como los esfuerzos de corte se han reportado el uso de NOA-1, un sensor altamente NO • -sensible indirecta 12 . En consecuencia, estos datos ponen de relieve que el Ca 2 + -evoked NO • formación de derivados de eNOS requiere un cierto tiempo de arranque hasta que se alcanza la actividad enzimática completa. Aunque la cinética de celular NO • formación, difusión y degradación pueden ser extraídos de otros datos, por ejemplo, las mediciones basadas en la tensión de NO • inducida por relajación de los vasosss = "xref"> 26, el gran beneficio de NO fluorescentes • sondas es que convierten directamente celulares NO • fluctuaciones en señales visibles en tiempo real. Por lo tanto, imágenes celulares NO • señales con geNOps proporcionan una alta resolución espacial y temporal, y ofrece posibilidades únicas de (re) investigar la (sub) celular NO • homeostasis. Por ejemplo, eNOS de imagen shuttling 42 en combinación con la tecnología geNOps en las células endoteliales individuales podría ser adecuado para correlacionar NO • formación con la localización subcelular y la translocación de la enzima NO • -producir u otras proteínas relevantes, tales como la calmodulina y la caveolina 43.

A continuación se describe la aplicación posible del G-GENOP que expresan las células HEK y EA.hy926 para visualizar de forma exógena y endógena generada celulares NO • Las señales en el nivel de una sola célula y en tiempo real en un campo de fluorescencia convencional de ancho microscope. Nuestros datos implican que geNOps son adecuados para realizar un seguimiento específico (sub) celulares NO • Dinámica en diversas condiciones experimentales utilizando todo tipo de tipos de células interesantes.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors acknowledge C.J. Edgell, Pathology Department, University of North Carolina at Chapel Hill, NC, USA for providing the EA.hy926 cells. Author E.E. is supported by Nikon Austria within the Nikon-Center of Excellence, Graz and is a fellow of the Ph.D. program in Molecular Medicine at the Medical University of Graz. The researchers are also supported by the Ph.D. program Metabolic and Cardiovascular Disease (DK-W1226) of the Medical University of Graz. This work was also funded by the FWF project P 28529-B27. Microscopic equipment is part of the Nikon-Center of Excellence, Graz that is supported by the Austrian infrastructure program 2013/2014, Nikon Austria Inc., and BioTechMed, Graz.

Materials

NaCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3957.20 sodium chloride
KCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6781.1 potassium chloride
CaCl2 .2H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany T885.1 calcium chloride dihydrate
MgCl2 .6H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2189.2 magnesium chloride hexahydrate
HEPES Carl Roth, Karlsruhe, Germany 9105.3 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
NaHCO3 Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8551.1 sodium hydrogencarbonate
KH2PO4 Merck, Darmstadt, Germany 104873 potassium dihydrogen phosphate
Na2HPO4 .2H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4984.1 sodium hydrogenphosphate dihydrate
D(+)-Glucose monohydrate Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6780.1 >99.5%; for cell culture, endotoxin free;
EGTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3054.2 ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid; calcium chelating agent
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6771.1 sodium hydroxide
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4625.1 hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N)
DMSO Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4720.1 dimethyl sulfoxide;  highly polar, aprotic organic solvent
L-Glutamic acid hydrochloride  Sigma Aldrich, Vienna, Austria G2128 (S)-2-Aminoglutaric acid
DMEM, low glucose Sigma Aldrich, Vienna, Austria D5523 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose; with 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture 
MEM Vitamin solution (100X) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11120037 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM)
MEM Amino acids solution (50X) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11130036 50X the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15140122.00 antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures
Amphotericin B Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15290026.00 Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi
FCS Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270106 Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin
PBS, pH 7.4 Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010031.00 phosphate-buffered saline
Fura-2 (AM) Teflabs, Austin, TX, USA 102 fluorescent cytosolic calcium indicators
Histamine dihydrochlorid Sigma Aldrich, Vienna, Austria H7250  2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist 
Nω-Nitro-L-arginine Sigma Aldrich, Vienna, Austria N5501 N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA;  inhibitor of nitric oxide synthase
NOC-7 Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany 487952 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release
Sodium nitroprusside dihydrate Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA sc-203395A sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound
30-mm Cover slips Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany 41001130 glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30-mm, (VE: 100 pcs.) 
Iron(II) booster solution Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells;  http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/
G-geNOp plasmid Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product/g-genop/
G-geNOp AAV5 Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/
G-geNOp sensor cell line Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/
HEK293A cell line Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA R70507 subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) 
EA.hy926 cell line American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany CRL-2922 somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549
TILL iMIC Till Photonics, Graefling, Germany n.a. digital microscope
Polychrome V monochromator Till Photonics, Graefling, Germany n.a. ultra fast switching
AVT Stingray F145B Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany n.a. Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b
alpha Plan Fluar 40 Zeiss, Göttingen, Germany n.a. x40 objective
dichroic filters Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA n.a. GFP emitter 514/3 nm (515dcxr)
ValveBank8 Controller AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA 01-08 programmable perfusion system control unit
BVC control Vacuubrand, Wertheim, Germany 727200 Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system
ImageJ software  NIH Image  Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome
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Eroglu, E., Rost, R., Bischof, H., Blass, S., Schreilechner, A., Gottschalk, B., Depaoli, M. R., Klec, C., Charoensin, S., Madreiter-Sokolowski, C. T., Ramadani, J., Waldeck-Weiermair, M., Graier, W. F., Malli, R. Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO•) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO• Signals in Single Cells. J. Vis. Exp. (121), e55486, doi:10.3791/55486 (2017).
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