JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

יישום של תחמוצת החנקן פלורסנט מקודדים גנטית (NO •) בדיקות, את geNOps, הדמיה בזמן אמת של אותות NO • ב תאים בודדים

Published: March 16, 2017
doi:
10.3791/55486
, , , , , , , , , , , , ,
1Institute of Molecular Biology and Biochemistry,Medical University of Graz

Summary

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO•) probes (geNOps) to monitor single cell NO• fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO• formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

Abstract

תחמוצת חנקן (NO •) היא רדיקלית קטן, אשר מתווך תפקודים תאיים חשובים מרובים ביונקים, חיידקים וצמחים. על אף קיומם של מספר רב של שיטות לאיתור NO • in vivo ו במבחנה, ניטור בזמן אמת של NO • ברמת-תא בודד הוא מאוד מאתגר. התופעות הפיזיולוגיות או פתולוגי של NO • נקבעות על ידי הריכוז בפועל וישבו זמן של שורש זה. בהתאם לכך, שיטות המאפשרות זיהוי מתחיל מתא הבודד של NO • הן רצויות מאוד. לאחרונה הרחבנו את המזרן של אינדיקטורים NO • על ידי החדרת תחמוצת החנקן מקודדים גנטית מבוססות חלבון פלואורסצנטי יחיד (NO •) בדיקות (geNOps) המגיבות ישירות לתנודות הסלולר NO • ומכאן, כתובות הצורך הזה. כאן אנו מדגימים את השימוש של geNOps להעריך אותות NO • תאי בתגובת שני כימי שונה NO • מולקולות -liberating. als התוצאות שלנוo ודא מוכן טרי 3- (2-הידרוקסי-1-מתיל-2-nitrosohydrazino) -N-מתיל-1-propanamine (NOC-7), בעל פוטנציאל גבוה הרבה לעורר שינוי ברמות תאיים NO • לעומת פרוסיד אורגני נתרן תורם NO • (SNP). יתר על כן, הדמיה כפול צבע לחיות תאים באמצעות geNOps הירוק (G-geNOp) ואת מחוון-כימי Ca 2+ פורעה -2 בוצעה כדי להמחיש את הרגולציה ההדוקה של Ca 2 + תלוי NO • היווצרות תאים בודדים האנדותל. ניסויי נציגים אלו מראים כי geNOps הם כלים מתאימים כדי לחקור את הדור בזמן האמת ושפלה של אותות מתא בודד NO • ב setups ניסיוני המגוון.

Introduction

פתחנו לאחרונה בכיתת רומן של בדיקות • NO פלורסנט מקודד גנטי, שנקרא geNOps 1. חיישנים אלה כוללים מובנים פשוט, חיידקים שמקורם, NO • מחייב מושלם 2, אשר מצומדות כדי חלבון פלואורסצנטי ברור (FP) גרסת 3 (ציאן, ירוק או כתום FP). NO • קשירה של ברזל ממקור צמחי (II) מרכז 4 בתוך geNOps מיידי מפחית את עוצמת הקרינה 1. חשוב לציין כי קרינת geNOps משחזרת במהירות ובאופן מלא כאשר רמות NO • תאי לרדת 1. בהתאם לכך, geNOps לאפשר הדמיה בזמן אמת של (תת) תנודות הסלולר NO •. למרות שמנגנון חישת NO • של geNOps עדיין אינו ברור עד כה, הם הוכיחו להיות כתבים מעולים NO •, ולכן יש את הפוטנציאל לפתוח עידן חדש של bioimagin הצבעוני, כמוני NO •g עם רזולוציות גבוהות במרחב ובזמן 1, 5. ניאון נוסף זמין NO בדיקות • מבוססות על תרכובות כימיות קטנות, אשר צריך להיות טעונים לתוך תאים, והם שונים באופן בלתי הפיך על ידי NO • 6. חסרונות נוספים של NO fluorophores הקטן הרגיש • הם cytotoxicity הפוטנציאל שלהם וספציפי נמוכים יחסית אשר מקשה להשתמש בם באופן אמין, אנליטיים חותך 7, 8, 9. למרות השימוש היעיל של בדיקות ניאון מקודדים גנטיים דורש טכניקות העברת גנים יעילות, FP-בסיס גנטי חיישנים מקודדים צמחו ככלים חיוניים כי חוללו מהפכה בהבנתנו את התפקוד הפנימי של תאים 10, 11. לפני הפיתוח של geNOps FP מבוסס יחיד, Fהעברת אנרגית תהודת örster (סריג) מבוססת NO חיישן •, המכונית NOA-1 12, נבנה. סאטו ואח. תוכנן בדיקה מתוחכמת זה מורכב משתי תת-יחידות של cyclase guanylate המסיס NO • -sensitive (SGC), הוא מצומדות לחיישני סריג מבוססי דיווח monophosphate guanosine המחזורית (cGMP) רמות 12. כמו בדיקה זו מגיבה cGMP, זה רק בעקיפין חש תנודות NO • תאיות 12. למרות NOA-1 מגיב גבה NO • בטווח ננו-טוחן, הכלי הזה לא נעשה שימוש לעתים קרובות עד כה, ככל הנראה בשל מגבלות באשר לזמינות הממשית של חיישן bipartite מגושם זה.

פונקציות צדדיות של NO •, אשר להשפיע מהותי תהליכים ביולוגיים מתאפיינים גם 13, 14. מחקרים רבים הוכיחו כי concentratio NO •n בתוך התאים ו תחומי משנה קובע גורל התא בבריאות ומחלות 14, 15, 16. בשנת mammalians, NO • הוא בעיקר שנוצר enzymatically בסוגי תאים שונים על ידי synthase תחמוצת החנקן גם מאופיין (NOS) משפחה 17. עד כה, שלושה isoforms של NOS תואר 18, 19, 20; אלה הם Ca 2 + / תלוי calmodulin אנדותל NOS (eNOS או NOS-3) 18 ו עצבי NOS (nNOS או NOS-1) 19, ואת Ca 2 + / calmodulin העצמאית constitutively פעיל מושרה NOS (אינוס או NOS- 2) 20. יתר על כן, קיומו של המיטוכונדריה NOS (mtNOS) גם הוצע 21. עם זאת, mtNOS נחשבת כווריאציה שחבור של nNOS, ועל כן אינה בנפרד מסווגת בתור איזופורם 21. עוד איזופורם, מלבד אלה בתאי יונקים, הוא NOS בקטריאלי שנקרא (ובנות), נמצא בעיקר חיידקים גראם-חיוביים 22. ההפקה האנזימטית של NO • נשלטת מאוד תלוי בזמינות של מספר קו-פקטורים כגון פוספט dinucleotide אדנין nicotinamide (NADPH), פלבין dinucleotide אדנין (FAD), tetrahydrobiopterin (BH4), חמצן מולקולרי ו- L-arginine 17. חומצת האמינו קטיוני L-arginine הוא המצע כי מומר L-Citrulline על NO הייצור • 17. בנוסף לדור האנזימטית הפיקוח ההדוק של NO •, זה כבר הניח כי רדיקלי ניתן להפחית הלא enzymatically מברכות ניטריט ידי המיטוכונדריה בתנאי חוסר חמצן 23. לאחר NO • מיוצר בתוך התא, הוא יכול לפזר בחופשיות דרך בביו-ממברנות 14,נ"צ "> 15. עם זאת, זמן מחצית החיים קצר מאוד של קיצוני זה נקבע בעיקר על ידי התנאים הסביבתיים, מסלולים שונים תגובות כימיות ביעילות לבזות רמות NO • 24. בסופו של דבר, ההיווצרות, דיפוזיה, והשפלה של NO • תלוי על פרמטרים סביבתיים מגוונים הקובע את הריכוז היעיל של המולקולה הפעילה ביולוגי מאוד 24.

טכנולוגית geNOps מאפשרת זיהוי הישיר של (תת) NO הסלולר • תנודות 1 ולכן הוא מתאים להוסיף ולחקור, שזה עתה לגלות את מנגנוני אחראי ההצטברות והפירוק של אותות סלולריים NO •. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים פשוטים ותוצאות נציג עבור השימוש של geNOps לדמיין עורר אקסוגני ו אנדוגני שנוצר פרופילים NO •, במישור של תאים בודדים. יתר על כן, הטכנולוגיה geNOps ניתן להתאים לכל apקפול במערכות מודל תאים אחרים ללמוד את התבניות המורכבות של היווצרות NO •, דיפוזיה, ושפלה בתגובה לגירויים הסלולר מגוונים מדגישה.

Protocol

1. הכנת חוצצי כימית ופתרונות הכן למאגר אחסון המכיל 135 mM NaCl, KCl 5 מ"מ, 2 מ"מ CaCl 2, 1 מ"מ MgCl 2, 10 HEPES מ"מ, 2.6 mM NaHCO 3, 0.44 מ"מ KH 2 PO 4, 0.34 מ"מ Na 2 HPO 4, 10 מ"מ D- גלוקוז, 2 מ"מ L- גלוטמין, ויטמינים MEM 1x, חומצות אמינו 1x MEM, 1% עט סטרפטוקוקוס, ו -1% amphotericin B. ממיסים את כל המרכיבים במים מזוקקים ומערבבים למאגר במשך 20 דקות באמצעות בוחש מגנטי בטמפרטורת החדר. התאם את ה- pH 7.44 באמצעות 1 M NaOH. עם תוספת dropwise של NaOH, למדוד pH באמצעות מד pH תוך ערבוב מתמיד. הכן חיץ פיזיולוגית Ca 2 + המכילים אשר מורכב של 140 מ"מ NaCl, KCl 5 מ"מ, 2 מ"מ CaCl 2, 1 מ"מ MgCl 2, 10 mM D- גלוקוז, ו -10 מ"מ HEPES. התאם את ה- pH ל -7.4 באמצעות NaOH כמתואר בשלב 1.1. הכן חיץ Ca 2 + ללא המורכב המרכיבים אותוכמפורט בשלב 1.2. השתמש 1 מ"מ EGTA במקום 2 מ"מ. Solubilize פורעה-02:00 ב- DMSO להשיג פתרון המניות 1 מ"מ. Aliquot פתרון מניות צלוחיות סגורות היטב ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך חודש עד אחד. אם קפוא, לאפשר פתרון המניות לאזן בטמפרטורת החדר למשך לפחות שעה 1 מוגן מפני אור. לדלל את הפתרון המניות פורעה-02:00 למאגר אחסון 1 מ"ל (שלב 1.1) כדי לקבל ריכוז סופי של 3.3 מיקרומטר. הכן 1 מ"ל של פתרון המניות היסטמין 100 מ"מ במים מזוקקים (pH 7.0). לדלל את פתרון המניות היסטמין 100 מ"מ 100 מיליליטר Ca 2 + המכיל חיץ פיסיולוגי לריכוז סופי של 100 מיקרומטר היסטמין. Nω-ניטרו-L-arginine Solubilize (L-NNA) ב 100 מ"ל של חיץ פיזיולוגית המכילים סידן כדי לקבל ריכוז סופי של 300 מיקרומטר. אחסן את הפתרונות על אמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 לפחות עד L-NNA נמס לגמרי. Solubilize 10 מ"ג NOC-7 ב wa מזוקקיםter (pH 7.0) כדי להשיג פתרון המניות 10 מ"מ. Aliquot פתרון מניית aliquots הקטן צלוחיות סגורות היטב ולאחסן מייד ב -70 ° C.. לדלל את פתרון מניות NOC-7 ב חיץ פיסיולוגי כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרומטר NOC-7. הערה: NOC-7 הוא תרכובת כימית קטנה אשר משחרר NO ספונטני עם זמן מחצית חיים קצר. תמיד להכין מאגרי העבודה שמורכב NOC-7 רק לפני כל ניסוי. ערוך nitroprusside נתרן 1 מ"מ פתרון (SNP) חיץ סידן פיסיולוגי להכין דילול 10 מיקרומטר. הערה: תמיד להכין כמויות קטנות (~ 10 מיליליטר) של פתרונות NO-התורם בגלל קצב ההידרדרות המהיר. הכן פתרון שנאגרו פוספט (PBS) המורכב 137 מ"מ NaCl, KCl 2.7 מ"מ, 9.2 מ"מ Na 2 4 HPO, ו -1.5 מ"מ KH 2 PO 4. התאם את ערך ה- pH 7.44 עם NaOH / HCl. 2. תא הכנה הערה: order להשיג אחידות בביצוע מדידת תחמוצת חנקן (NO •) בתאים יחידים באמצעות geNOps, תאים צריכים להיות מראש מודגרות עם ברזל (II) / המכילה ויטמין C חיץ לפני ניסויי הדמיה כדי להחזיר Fe 2+ בתוך תחום -binding NO • של NO • -probes. במקרה של תאי EA.hy926 ו HEK293, דגירה במשך 20 דקות עם ברזל הפתרון המאיץ (II) מוביל הפעלה מלאה של חיישני NO •. זרעים 5.5 x 10 5 EA.hy926 או HEK293 תאים למחרת או 3.5 x 10 5 תאים ליום שאחרי למחרת, על כוסות כיסוי מיקרוסקופ 30 מ"מ לתוך באר של צלחת 6 באר. דגירה התאים ב 37 ° C בסביבת humidified עם 5% CO 2. הערה: מידע מפורט לגבי זיהום adenoviral של בתאי יונקים ובניית וירוס תוארה על ידי ג'אנג et al. 25. צעד זה אינו חל על תאי 293 HEK להביע G-geNOp ביציבות. קח העובר עגל בסרום (FCS) ו אנטיביוטיקה ללא בינוני שונה נשר של Dulbecco (DMEM) ולהוסיף וירוס adeno הקשורים מסוג 5 (AAV5) וקטור נושאת את הגן המקודד עבור G-geNOp (משרד הפנים: 500 עבור תאים EA.hy926 להניב כמעט 100 תאים חיוביים%; משרד הפנים: 1 הוא יעיל HEK293 תאים). הערה: שימוש וקטורים ויראליים adeno הקשורים מוקצה בקבוצת סיכון 2. בלימת בטיחות ביולוגית ברמת 2 נדרשה בדרך לעבודה עם וקטור זה. במידת הצורך, הידבקות בווירוסים יכול גם להתבצע FCS המכיל בינוני. לחלופין, תאים יכולים להיות transfected זמני באמצעות נישאי שומנים מבוססים 1. הסר בינוני התרבות תאים לשטוף עם מחומם מראש (37 ° C) PBS. הוסף 1 מ"ל של מדיום DMEM / AAV5 על כל טוב עבור שעה 1. צעד זה אינו חל על תאי 293 HEK להביע G-geNOp ביציבות. הוסף 1 מ"ל של 20% FCS המכיל DMEM על כל טוב לריכוז סופי של 10% FCS. אל תסיר את תקשורת AAV5 המכיל מהתאים. ג'ֶנטֶלמֶןly מתנדנד צלחת homogenize המדיום בתוך הבארות. דגירה תאים עבור 48 שעות ב 37 ° C בסביבת humidified עם 5% CO 2. צעד זה אינו חל על התאים 293 HEK להביע G-geNOp ביציבות. לאחר 48 שעות, לשטוף תאים עם PBS מחומם מראש. בהמשך להוסיף 2 מ"ל מחומם מראש למאגר אחסון (סעיף 1.1) זה טוב דגירה התאים ב חדר RT לפחות 1 hr מוגן מפני קרינת אור. החלף למאגר אחסון עם 1 מ"ל / טוב של ברזל (II) פתרון המאיץ בטמפרטורת החדר (RT). דגירת תאים עבור בדיוק 20 דקות בחושך. הערה: אין לעבור או להפחית את זמן דגירה האופטימלי משום שהדבר עשוי להשפיע על יכולת התגובה של חלליות NO •. שטפו תאים פעם עם למאגר אחסון דגירה כל טוב עם למאגר אחסון 2 מ"ל במשך שעה לפחות 2 ב RT כדי לאפשר לתאים לאזן. החלף למאגר אחסון עם 3.3 מיקרומטר פורעה-02:00 במאגר אחסון 1 מ"ל במשך 45 דקות ב RT, מוגןמן האור. שטפו תאים פעמיים עם חיץ אחסון דגירה, שוב 30 דקות לפחות כדי לאפשר לתאים לאזן. 3. הדמיה של תא חי NO • ו Ca 2 + אותות בתאים בודדים תקן תלוש כיסוי 30 מ"מ מצופה תאים EAhy.926 או HEK293 (משלב 2.1) בתא מתכת זלוף ומניחים אותו על המיקרוסקופ. חברו את צינור זרם אל מאגרי חיץ ואת בזרימת כדי משאבת ואקום. ודא זרימה עקבית ולהימנע ניקוז של להחליק את המכסה. הפעל את זלוף הכבידה מונחה עם חיץ סידן פיסיולוגי (משלב 1.2) באמצעות מערכת טפטוף חצי אוטומטית. הערה: מערכת כזו מורכבת מאגרי חיץ, צינורות בהתאמה, שסתומים מגנטי הנשלטות באופן אלקטרוני משאבת ואקום (ראה איור 1B). קצב הזרימה יכול לנוע בין 1 ל 3 מ"ל / דקה, תלוי בגובה של מאגרי זלוף. לקבלת appli סמים המקומי העקביקטיון, את קצב הזרימה של כל מאגרי המים המשמשים צריך להיות שווה בערך. זה צריך להיבדק לפני ניסויי הדמיה. תחשוב על זה תא אנדותל להגיב גדל לחץ גזירה אשר יכול להיגרם על ידי זלוף קפדני. הפעל את מערכת ההדמיה ולאפשר להתחמם של כל המכשירים למשך 30 דקות. לקבוע את הגדרות הדמיה באמצעות תוכנה מתאימה. גל עירור בחר 340 ננומטר ו -380 ננומטר עבור הדמיה פורעה-2 ו -480 ננומטר עבור G-geNOp מרגש. כדי למזער הלבנת קרינה להגדיל את binning המצלמה 4 ולהפחית עוצמות עירור זמן חשיפה. ראה גם צעדים 3.6-3.8. הערה: הגדרות הדמיה ופרמטרים תלויות המכשירים המשמשים, פורעה-2 יעילות העמסה G-geNOp רמות ביטוי. בחר את אזור ההדמיה ידי הזזת שולחן xyz של המיקרוסקופ עד תאי ניאון כמה נמצאים במוקד. ואז להגדיר אזורים של עניין (ROIs) באמצעות כלי תוכנה בהתאמה. צייר אזורים מכסה מספר שלם Singlדואר תאים פלורסנט לכל שדה הדמיה ידני. בנוסף, להגדיר אזור רקע בגודל דומה. הערה: לאחר התמונות נרכשו ומאוחסנים ROIs ניתן להגדיר גם עתה לאחר תהליך הדמיה לניתוח נוסף באמצעות תוכנת ניתוח הדמיה בהתאמה (ראה חומרים רשימה). התחל באיסוף נתונים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך והמתקדם עם במה מדגמת ממונעת, ומקור אור מונוכרומטי. לחילופין לרגש ב 340 ננומטר ו -380 ננומטר עבור פורעה-02:00 ו -480 ננומטר עבור G-geNOp, בהתאמה. גדר זמן חשיפה בהתאמה כך עבור כל הערוצים, אות קרינה ברורה ניתן לזהות לאורך זמן. ראה גם צעד 3.4. הערה: זה תלוי בעוצמת אור העירור ואת binning המצלמה. לדוגמה, להשתמש בעוצמה 15% של אור עירור, binning המצלמה של 4 ו -150 ms עבור 340 ננומטר, 50 ms עבור 380 ננומטר, ו -300 ms עבור 480 ננומטר. ראה גם צעד 3.4. אסוף את האור הנפלט ב 510 ננומטר עבור פורעה-2 / AM, 520 ננומטר עבור G-Genop באמצעות מצלמה תשלום מצמידים מכשיר (CCD) עם סט פילטר מתאים המורכב של exciter 500 ננומטר, dichroic 495 ננומטר פולט 510-520 ננומטר. שיא מסגרת כולל אחד כל 3 שניות. רשום את הדקות הראשונות (במידת צורך עד 3 דקות) במאגר פיסיולוגי Ca 2 + (1.2) כדי לקבל את הבסיס של אותות קרינה בהתאמה לאורך זמן. פעם קרינת בסיס יציבה הוא ציין, לעבור 100 מיקרומטר היסטמין או ATP (1 מיקרומטר או 100 מיקרומטר) המכיל חיץ פיסיולוגי Ca 2+ כדי לעורר תאים במשך 3 דקות. הערה: תאי EA.hy926 המגיבים אגוניסטים מצביעים על עלייה חדה של יחס פורעה-2 (קרינה הנרגשת ב 340 ננומטר מחולק באמצעות קרינה מתרגשת 380 ננומטר) וירידה ברורה של אותות קרינת G-geNOp. חלף חזרה למאגר הפיזיולוגי Ca 2 + ללא היסטמין או ATP ו- L-NNA במשך 5 דקות כדי להסיר את התרכובות מהתאים. צעד זה עשוי להיות ממושך עד פלורסנטשינויים דעך הם התאוששו לחלוטין. לנהל 10 מיקרומטר NOC-7 במאגר פיסיולוגי Ca 2 + 2 דקות באמצעות מערכת זלוף. תורם NO מאוד משפיע קרינת G-geNOp אשר בדרך כלל יורדת> 20% בתגובת 10 מיקרומטר NOC-7. בתאי EA.hy926 השפעת NOC-7 היא כ 3 קיפול חזק לעומת אגוניסט מושרה להרוות קרינת G-geNOp. יש לשטוף היטב את מתחם NO • -releasing במשך כ -10 דקות עם Ca הפיזיולוגי 2+ חיץ לעצור את ההקלטה הוא התאוששה קרינת בסיס פעם. ניתוח 4. נתונים יצוא רכשה נתונים עוצמים קרינה הממוצעת של תאים בודדים לאורך זמן, אל תוכנת ניתוח נתונים. הפחת ערכים רקע בהתאמה ולחשב את היחס של 340 ננומטר על ידי 380 ננומטר של אותות פורעה -2 המתאימים לכל תא בודד לאורך זמן. הפחת את ערכי הרקע של הערוץ G-geNOp להשיג את fl בפועלuorescence עוצם חללית NO (F) לאורך זמן באמצעות כל תוכנת חישוב. קח ערכי קרינת בסיס כמו F 0 (F 0 הוא את הקרינה של חללית NO לאורך זמן ללא גירוי). ראה גם צעד 4.5 ואיור 1C. חישוב פונקציה לאורך זמן את ההשפעות לבנות קרינה באמצעות המשוואה הבאה: F 0 = F inital • exp (-K • זמן) + רמת F. F inital: אות הקרינה מקסימלית פעם הדמיה הוא התחיל; K: מתמיד בשיעור של הלבנת הקרינה לאורך זמן; F רמה: מינימום קרינה אליה הגיע הלבנה לאורך זמן; ראה גם צעדים 4.3- 4.4 ואיור 1C. הערה: לקבלת הקירוב, כל ערכי הקרינה לאורך זמן לפני ואחרי גירוי תא עשויים לשמש. פרטים נוספים שצוינו על ידי ואח 'בנטלי. 27. כדי לנרמל את האות G-geNOp לאורך זמן, לחשב 1-F / F0 (שלבים 4.3-4.5). ראה תרשים 1C ו 1D.

Representative Results

ויזואליזציה של פרופילים מתא בודד NO • בתגובה הזמנית יישומית NO תורם השתמשנו שיבוט תאים HEK אשר ביציבות מבטא G-geNOp (איור 1 א), על מנת להמחיש NO אותות • על התא ברמה אחת מענה לשתי תרכובות כימיות קטנות שחרור-NO שונים, NOC-7 ו- SNP. תורמי NO • ברציפות יושמו והוציאו מתאים במהלך ההדמיה באמצעות מערכת טפטוף מבוסס הכבידה שהבטיחה זרימה רציפה (איור 1 ב). כל התאים המבטאים G-geNOp עם עוצמות שונות הראו ירידה ברורה של הקרינה בתגובה NOC-7 ו- SNP (תרשים 1C), המציין מהיר הצטברות NO • בתוך התאים על תוספת של התורמים NO •. אותות הקרינה מנורמל (1-F / F 0) הוכיחו כי הן התורמים NO • עורר cellula הומוגניתr NO • הגבהים שהחלימו לחלוטין על כשלון של תרכובות -releasing NO • (1D איור). עם זאת, 10 מיקרומטר SNP המושרה רק 50% של האות הסלולרי NO • (9.63 ± 1.05%, n = 3/38) כי הושג ב -10 מיקרומטר NOC-7 (18.10 ± 1.20%, n = 3/38, p < 0.0001). על מנת להשיג רמות NO • תאיות שווות בשני NO • תורם, בריכוז של 1 מ"מ של SNP נדרש (1C הדמוי, 1D). לאחר מכן, בדקנו את הקיבולת של מוכן טרי לעומת פג NOC-7 להעלות את רמות NO • תאיות בתאי HEK. לשם כך, הכנו ארבעה מאגרי ניסיוני המכילים 5 מיקרומטר-7 NOC. תורם NO • גם נוסף טרי רק לפני המדידה, או כל זמן בתוך מאגרים עבור שעה 1, 2 שעות, ו -3 שעות בטמפרטורת חדר לפני המדידה. המאגרים השונים ברצף יושמו והוציאו fROM התאים המבטאים G-geNOp באמצעות מערכת זלוף (איור 2 ב). גישה זו חשפה את היציבות של פתרונות NOC-7 מימית אשר, כצפוי, נראה ירידה יכול לאורך זמן כדי להעלות את רמות NO • תאיות (איורים 2A, 2C). מעניין לציין, כי אין • אותות התאוששו מהר יותר באופן משמעותי עם הסרת מאגרים פגים, לעומת תגובת NO • תאי כי הייתה עורר על ידי-7 NOC טריים (איור 2 ג), אולי הדבקה מציינת של שלמי NO • מולקולות -liberating בבית מרכיבים תאיים . ויזואליזציה סימולטני של Ca 2 + ו NO • אותות לתאי אנדותל יחידים כדי ללמוד Ca 2 + -triggered NO היווצרות • בתאי האנדותל, את פונדקאית תא הנציח הנפוץ אנדותל, שורת תאים EA.hy926, היה transiently טרנספקציה עם G-geNOp עמוסה בבוקר / פורעה-2 (ראה פרוטוקול 2.8). Transfection הניב כ 10% מתאי אנדותל חיוביים G-geNOp (n = 6, איור 3 א), וזה מספיק כדי להקליט Ca 2 + -evoked NO ייצור • במישור של תאי אנדותל יחידים. עם זאת, השגנו כמעט 100% G-geNOp החיוב תאי EA.hy926 באמצעות וקטור ויראלי adeno קשור (n = 6; ראה פרוטוקול 2.2). לפני מדידות רבות, תאים הודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר במאגר אחסון מורכבים L-NNA, בלתי הפיך NOS-מעכב 26 חזק. תאי בקרה הוחזקו למאגר אחסון אותו דבר בלי L-NNA (ראה פרוטוקול 1.1) (איור 3 ב). טיפול של תאים מלאים עם היסטמין, אגוניסט -generating 1,4,5-אינוזיטול טריפוספט חזק (IP 3), cytosolic מוגבה באופן מיידי Ca 2 + רמות ואחריו לעלייה הדרגתית של תאיים NO • עד אגוניסט היה להוריד(איורים 3C, 3D) ד. תאים טרום שטופלו במעכבי NOS הראו אותות cytosolic Ca 2+ דומים, ואילו הרמה • NO התאית נותרה בעינה כמעט בתגובת היסטמין (האיור 3E). EA.hy926 תאים מבטאי G-geNOp טופלו גם עם 1 מיקרומטר ו -100 מיקרומטר של IP 3 -generating ATP אגוניסט כדי לברר אם יש או לא geNOps מתאים לפקח NO אותות • בתגובה הוא נמוך פיסיולוגי על-פיסיולוגי ריכוזים של אגוניסט (איור 3F). בשנות ה ATP מיקרומטר התא קו 1 אנדותל עורר איתות ברור cytosolic NO •, שהיה כמחצית האות המתקבל על ידי 100 מיקרומטר ATP (איור 3F). איור 1: פרופילי NO תאי בתגובה ל NO-liberati השונה ng מולקולות. (א) תמונות שדה רחב של תאים HEK להביע ביציבות cytosolic G-geNOp. בר סולם = 20 מיקרומטר. (ב) איור סכמטי של מערכת זלוף חצי אוטומטי מבוסס הכבידה על יישום מבוקר והסרה של NOC-7 ו- SNP. (ג) נציג (מתוך 3 ניסויים בלתי תלויים) הלא מנורמל עוצמת הקרינה תא בודד עקבות ביחידות כלשהן לעומת הזמן של תאים HEK להביע ביציבות cytosolic G-geNOp בתגובה 10 מיקרומטר NOC-7, 10 מיקרומטר SNP, ו 1 מ"מ SNP. עקום שחור מודגש מייצג את עקומת הממוצע של 26 עקבות תא בודד (עקומות אפורות בהירות). עקומת שחור מנוקד מייצג F 0, אשר שימש נורמליזציה. (ד) עקבות יחידות מנורמלות הפוכות (1-F / F 0, עקומות אפורות בהירות), ולהתכוון עקומה (עקומה מודגשת שחורה) לאורך זמן בתגובת 10 מיקרומטר NOC-7, 10 SNP מיקרומטר, ו 1 המ"מ SNP מופקת לוח גes / ftp_upload / 55,486 / 55486fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2: מבחן היציבות של NOC-7 באמצעות ביציבות G-geNOp לבטא בתאי HEK. (א) עקומת תגובת ריכוז נציג NO • לאורך הזמן של ביציבות G-GeNOps לבטא בתאי HEK על פי בקשה של תמיסות בופר טריות וישנות NOC-7. כל מאגרים המכילים NOC-7 הוכנו בתחילה עם ריכוז סופי של 5 מיקרומטר באמצעות אותו פתרון המניות (50 מ"מ). השעה חלוף הפתרונות המתאימים לאחר הכנה עד כמויות הדמיה עד 1 שעה, 2 שעות, ו -3 שעות כפי שצוין. (ב) איור סכמטי של מערכת זלוף חצי אוטומטי מבוסס הכבידה כדי ברציפות להוסיף ולהסיר פתרונות NOC-7 המכיל במהלך ההדמיה. (C) מתאמים זמניים שלאותות סלולריים NO • בתגובה טרייה מאגרי NOC-7 ישנים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3: הדמיה רבה סימולטני של NO • ו Ca 2 + אותות בתאי EA.hy926 יחידים. (א) תמונות הקרינה רחב בתחום נציג של תאים EAhy.926 להביע G-geNOp (פאנל משמאל) הנטענים עם פורעה-2 / AM (באמצע לוחות מימין). בר סולם = 20 מיקרומטר. (ב) איור סכמטי של טיפול תאי EAhy.926 עם 500 מיקרומטר Nω-ניטרו-L-arginine (L-NNA) במשך 20 דקות בתוך צלחת שש היטב לפני המדידה. (C) כמובן נציג זמן של שיא סימולטני של פורעה-2 (עירור: 340 ננומטר / 380 ננומטר emissיון: 510 ננומטר) ואותות G-geNOp (עירור: ננומטר 480; פליטה: 520 ננומטר) בתגובה 100 היסטמין מיקרומטר. כמו היסטמין מצוין הוסר לאחר 3 דקות באמצעות מערכת טפטוף. (ד) Curves מייצג הקלטות בו זמניות של cytosolic Ca 2 + (פורעה-2 אותות יחס, F 340 / F 380 הוא אפור קו מוצק) ו NO • (עקום מנורמלת הפוך, 1-F / F 0 הוא קו מוצק ירוק) אותות לאורך זמן של G-geNOp יחיד פורעה-2 / aM טעון תא האנדותל להביע זמני. תאים היו מגורה עם 100 מיקרומטר היסטמין עבור 3 דקות בתוך Ca 2 + (2 מ"מ CaCl 2) המכיל חיץ (n = 8/3). (ה) נציג רשמה בו זמנית Ca 2 + (קו מוצק אפור) NO • (קו מוצק ירוק) אותות לאורך זמן של תא EA.hy926 כי היה pretreated עם 500 מיקרומטר Nω-ניטרו-L-arginine (L-NNA) לפני מדידה (n = 12/3). תאים שטופלו עם 100 מיקרומטר היסטמין בנוכחות של 2 מ"מCa 2+. (F) עקומות ממוצעות הייצג אותות NO • cytosolic בתגובת 1 ATP מיקרומטר ואחריו גירוי תא שני עם 100 ATP מיקרומטר. ברים מייצגים ערכים ממוצעים ± סטיית התקן של אותות מקסימאליים G-geNOp בתגובת 1 ATP מיקרומטר (פס לבן) ו -100 ATP מיקרומטר (פס ירוק) של 4 ניסויים בלתי תלויים; p <0.001 לעומת 1 ATP מיקרומטר. P-value חושב באמצעות מבחן t מזווג. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

מאז גילויו של NO • בתור מולקולת איתות חשובה בביולוגיה 28, המדידה בזמן אמת המסוימת של רדיקלי תאים בודדים, רקמות חיות שלמות עם רזולוציה גבוהה באופן ריאלי ואמין כבר שאפתה. כאן אנו מדווחים על היישום של בדיקות • NO פלורסנט גנטי לאחרונה פתחו מקודד (geNOps) המאפשרים מדויק Live- תא הדמיה של אותות NO • באמצעות קרינה רחבה בתחום מיקרוסקופיה 1.

כדי לעקוף נהלים transfection משוכלל פולשנית שיבוט תאים HEK המבטא שימש G-geNOp פלואורסצנטי ירוק ביציבות לכמת שנוצר אקסוגני פרופילים תא בודד NO •. ככל שתאי HEK בדרך כלל אינם מייצרים NO • אנדוגני 29, סוג תא זה מתאים לדור של קו תא חיישן מבוסס geNOp, אשר עשוי להיות שימושי עבור יישומים רבים אחרים בתנאי שיתוף התרבותעם NO • הפקה אפילו או תאים ראשוניים לחיות חיים 30. עם זאת, במחקר זה אנו מדגימים את היכולת של שונות NO • תרכובות -liberating, של ריכוזים stabilities שונים, כדי לעורר אותות תאיים NO • השימוש במודל תא G-geNOp להביע HEK. הנתונים שלנו גילו כי ריכוז NO • -donor, איכות שיטת היישום בסופו של דבר לקבוע את דפוסי פרופילים תאיים NO •. מידע כזה הוא הכרחי עבור אפיון pharmacokinetic באתרו של תורמים שונים NO •, המעידים על מחלות שונות. יש לציין, הוכח geNOps להגיב ביציבות ליישומים חוזרים מרובים של NO • -donor פולסים לאורך זמן מאוד ארוך 1. בהתאם לכך, ניסויים באמצעות NO • -liberating תרכובות המוצגת כאן, לאפשר מסקנות וכמותיות לגבי אמפליטודות קינטיקה שונים של NO הסלולר בהתאמה226; אותות (איורים 1 ו -2).

למרות שיבוט תאי HEK להביע ביציבות כנראה מקורו מתא בודד, הטרוגניות רחב של רמות ביטוי G-geNOps נצפה (איור 1). זוהי תכונה משותפת של שיבוטי תא יציבים כמו השעתוק של הגן (משולב הגנום) של עניין הוא בשליטת גורמים רבים כגון לחצים סביבתיים מגוונים 31 ההשפיע שיעורי צמיחת תאי 32, ואת מחזור התא 33 במצב. GeNOps FP-היחיד המבוסס הם בדיקות הלא ratiometric ו, ומכאן, אין • -induced אובדן עליות עוצמות קרינה עם רמת ביטוי geNOp 1. בהתאם לכך, נורמליזציה של אותות geNOps חיונית לכימות אותות NO • הסלולר במיוחד במקרה של ניתוח השוואתי. כפי שניתן לראות במחקר האחרון שלנו, ב קשר לינארי קפדןetween את עוצמת הקרינה הבסיס של geNOps ואת הכוח של מרווה הקרינה -induced NO • על פני מגוון רחב של עוצמות הקרינה נמצאה 1. זוהי תכונה חשובה של geNOps כימות מוחלטת של אותות סלולריים NO •. כפי שניתן לראות בתרשים 1, נורמליזציה של אותות G-geNOps בתגובת NOC-7 ו- SNP גילה אותות NO • הומוגנית בתאי HEK שונים מאותה הצלחת, המציין כי תאי HEK אינם מגוונים לגבי יכולת תופסים ו לבזות את NO • רדיקלי כי מקורו תורם NO •. לעומת זאת, באמצעות geNOps בתאים הלה הפגין heterogeneities הברורה של אותות סלולריים NO • בין תאים שונים בתגובת NOC-7. הבדלים אלה מצביעים על קצב חילוף חומרים ופירוק סוג תא ספציפי NO •, אשר עשוי להיות לכך השלכות מרובות בפיזיולוגית תא והפתולוגיה, והוא יכול להיחשף באמצעות geNOpהטכנולוגיה של.

אף על פי כן, שתי תכונות חשובות של geNOps צריכים להישקל בזהירות עבור השימוש הנכון של החיישנים ופרשנויות נתונים: i) geNOps זקוק לברזל נאות (II) להגיב באופן מלא ל NO • 1 ו- II) תלוי גרסת FP, geNOps יכול להיות pH 1 רגיש. כאן אנו מתארים פרוטוקול כי כבר מצאו להיות מתאים ברזל רעיל (II) תוספת של geNOps, אשר באים לידי ביטוי גם HEK, הלה או תאים EA.hy926 (ראה פרוטוקול 2.6). למרות שזה הוכח כי טיפול בתאים עם ברזל (II) / ויטמין C לא השפיעה מורפולוגיה תא, כדאיויות תא פעילות המטבולית של תאי 1, זה עשוי להיות חיוני כדי לייעל את זה צעד חשוב עבור סוגי תאים ורקמות אחרים. עם זאת, בכמה תנאי ניסוי, הדרישה של ברזל (II) טעינה עשויה להגביל את תחולת geNOps. יש לציין, הוכח כי ascorbate יכול להפחית NO • 35 ו ascorbate-ברזל (II) מתחמים מסוגלים ללקט NO • 36, 37. יתר על כן, עודף ברזל (II) ו ascorbate יכול לגרום תגובות דלקתיות 39 ו לִשְׁמוֹט eNOS 41. השפעות אלה צריכים להילקח בחשבון בעת ​​שימוש בטכנולוגית geNOps. הוכח כי בתנאים ניסיוניים מסוימים, ה- pH התאי מושפע באופן משמעותי 34, אשר יש הפוטנציאל להשפיע על geNOps קרינת 1. יש לציין, כי וריאנטים ציאן geNOps הירוק יחסית pH רגישים המראה ירידה של קרינה על החמצת 1. לפיכך, שינויים חדים של pH הסלולר (תת) עשויים לדמות אותות שווא NO • בעת שימוש geNOps pH הרגיש. כפי שהוצע בעבודה הקודמת שלנו, את השימוש במקביל של NO geNOps • הרגיש (mut geNOps) כמו מערכות בכל שליליתls מומלץ לנתח אות NO • הסלולר אמיתי pH משתנה 1. בנוסף לשינויים pH הסלולר יכול להיבדק באמצעות בדיקות pH כגון SypHer 34.

יתר על כן, אנו מדמיינים היווצרות אנדוגני האנזימטית NO • בתגובת אגוניסט -mobilizing פיסיולוגי Ca 2+ בתא אנדותל EA.hy926 הפונדקאית. שורת תא EA.hy926 היא מערכת מודל המשמשת לעתים קרובות להביע באופן עקבי 38 אינס. השימוש geNOps הביע זמני בתאים EA.hy926, אישר כי IP 3 בתיווך 2+ אותות Ca לעורר היווצרות NO • עמוק סוג תא זה, אשר כמעט נחסם לחלוטין על ידי L-NNA. כדי זמנית לתאם Ca 2 + עם NO אותות •, G-geNOp להביע תאים הועמסו עם Ca כימיים להתרגש-UV 2+ -indicator פורעה-2 / AM. ההפרדה הספקטרלית של Ca 2 + כבול fluo פורעה-2 מאוגד rescence מן אות G-geNOp יכול להיות מושגת בקלות עם ערכות 40 מסנן זמין מסחרי. בדיקות הדמיה הן חשפה כי היווצרות Ca 2+ -triggered האנזימטית NO • מתרחשת הרבה יותר איטית לעומת הגידול 2+ Ca cytosolic בסוג תא האנדותל זה. קינטיקה דומה אותות מתא בודד NO • בתאי האנדותל מן עורק ריאה שור על טיפול בתאים עם ברדיקינין אגוניסט IP 3 -generating, וכן מדגיש גזירה דווחה באמצעות NOA-1, חיישן -sensitive עקיף ביותר NO • 12 . לפיכך, נתונים אלה מדגישים כי Ca 2 + -evoked eNOS הנגזרות היווצרות NO • דורשת זמן התחלה מסוים עד פעילות האנזימטית המלאה הוא הגיעה. למרות קינטיקה של היווצרות הסלולר NO •, דיפוזיה והשפלה ניתן להפיק נתונים אחרים, כגון מדידות מבוססות המתח של NO • -induced הרפיה כליss = "Xref"> 26, היתרון הגדול של בדיקות • NO פלורסנט הוא שהם ישירות להמיר תנודות הסלולר NO • לאותות גלויים בזמן אמת. לפיכך, הדמית NO הסלולר אותות • עם geNOps מספק רזולוציה מרחבית גבוהה ובזמן, ומציעים אפשרויות ייחודיות ב (מחדש) חוקרים את (תת) הומאוסטזיס הסלולר NO •. לדוגמה, הדמיה eNOS shuttling 42 בשילוב עם הטכנולוגיה geNOps בתאי האנדותל יחיד עשוי להיות מתאים כדי לתאם NO היווצרות • עם לוקליזציה subcellular טרנסלוקציה של NO • -producing אנזים או חלבונים רלוונטיים אחרים כגון calmodulin ו caveolin 43.

כאן אנו מתארים את היישום המעשי של G-geNOp לבטא בתאי HEK ו EA.hy926 לדמיין אקסוגני ו אנדוגני שנוצרו אותות סלולריים NO • במישור התא הבודד ו בזמן אמת על מטר קרינה בשדה רחב קונבנציונליicroscope. הנתונים שלנו לרמוז geNOps מתאים לעקוב במיוחד (תת) דינמיקת סלולר NO • תחת תנאי ניסויים שונים תוך שימוש בכל מיני סוגי תאים מעניינים.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors acknowledge C.J. Edgell, Pathology Department, University of North Carolina at Chapel Hill, NC, USA for providing the EA.hy926 cells. Author E.E. is supported by Nikon Austria within the Nikon-Center of Excellence, Graz and is a fellow of the Ph.D. program in Molecular Medicine at the Medical University of Graz. The researchers are also supported by the Ph.D. program Metabolic and Cardiovascular Disease (DK-W1226) of the Medical University of Graz. This work was also funded by the FWF project P 28529-B27. Microscopic equipment is part of the Nikon-Center of Excellence, Graz that is supported by the Austrian infrastructure program 2013/2014, Nikon Austria Inc., and BioTechMed, Graz.

Materials

NaCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3957.20 sodium chloride
KCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6781.1 potassium chloride
CaCl2 .2H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany T885.1 calcium chloride dihydrate
MgCl2 .6H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2189.2 magnesium chloride hexahydrate
HEPES Carl Roth, Karlsruhe, Germany 9105.3 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
NaHCO3 Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8551.1 sodium hydrogencarbonate
KH2PO4 Merck, Darmstadt, Germany 104873 potassium dihydrogen phosphate
Na2HPO4 .2H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4984.1 sodium hydrogenphosphate dihydrate
D(+)-Glucose monohydrate Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6780.1 >99.5%; for cell culture, endotoxin free;
EGTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3054.2 ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid; calcium chelating agent
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6771.1 sodium hydroxide
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4625.1 hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N)
DMSO Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4720.1 dimethyl sulfoxide;  highly polar, aprotic organic solvent
L-Glutamic acid hydrochloride  Sigma Aldrich, Vienna, Austria G2128 (S)-2-Aminoglutaric acid
DMEM, low glucose Sigma Aldrich, Vienna, Austria D5523 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose; with 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture 
MEM Vitamin solution (100X) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11120037 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM)
MEM Amino acids solution (50X) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11130036 50X the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15140122.00 antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures
Amphotericin B Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15290026.00 Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi
FCS Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270106 Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin
PBS, pH 7.4 Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010031.00 phosphate-buffered saline
Fura-2 (AM) Teflabs, Austin, TX, USA 102 fluorescent cytosolic calcium indicators
Histamine dihydrochlorid Sigma Aldrich, Vienna, Austria H7250  2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist 
Nω-Nitro-L-arginine Sigma Aldrich, Vienna, Austria N5501 N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA;  inhibitor of nitric oxide synthase
NOC-7 Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany 487952 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release
Sodium nitroprusside dihydrate Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA sc-203395A sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound
30-mm Cover slips Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany 41001130 glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30-mm, (VE: 100 pcs.) 
Iron(II) booster solution Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells;  http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/
G-geNOp plasmid Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product/g-genop/
G-geNOp AAV5 Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/
G-geNOp sensor cell line Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/
HEK293A cell line Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA R70507 subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) 
EA.hy926 cell line American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany CRL-2922 somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549
TILL iMIC Till Photonics, Graefling, Germany n.a. digital microscope
Polychrome V monochromator Till Photonics, Graefling, Germany n.a. ultra fast switching
AVT Stingray F145B Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany n.a. Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b
alpha Plan Fluar 40 Zeiss, Göttingen, Germany n.a. x40 objective
dichroic filters Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA n.a. GFP emitter 514/3 nm (515dcxr)
ValveBank8 Controller AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA 01-08 programmable perfusion system control unit
BVC control Vacuubrand, Wertheim, Germany 727200 Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system
ImageJ software  NIH Image  Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eroglu, E., et al. Development of novel FP-based probes for live-cell imaging of nitric oxide dynamics. Nat Commun. 7, 10623 (2016).
  2. Bush, M., et al. The structural basis for enhancer-dependent assembly and activation of the AAA transcriptional activator NorR. Mo. Microbiol. 95 (1), 17-30 (2015).
  3. Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nat. Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
  4. D’Autréaux, B., Tucker, N., Spiro, S., Dixon, R., Poole, e. d. .. P. o. o. l. e. ,. R. .. K. .. ,. (. e. d. ). .. ,. Characterization of the Nitric Oxide-Reactive Transcriptional Activator NorR. Globins and Other Nitric Oxide-Reactive Proteins, Part B. 437, 235-251 (2008).
  5. Strack, R. Sensors and probes: Yes to genetically encoded NO• sensors. Nat Methods. 13 (4), 288 (2016).
  6. Auten, R. L. Response to ‘The use of diaminofluorescein for nitric oxide detection: Conceptual and methodological distinction between NO and nitrosation. Free Radic. Biol. Med. 50 (12), 1812 (2011).
  7. Sivaraman, G., Anand, T., Chellappa, D. A Fluorescence Switch for the Detection of Nitric Oxide and Histidine and Its Application in Live Cell Imaging. ChemPlusChem. 79 (12), 1761-1766 (2014).
  8. Ye, X., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Detection of nitric oxide in single cells. Analyst. 133 (4), 423-433 (2008).
  9. Thyagarajan, B., Malli, R., Schmidt, K., Graier, W. F., Groschner, K. Nitric oxide inhibits capacitative Ca2+ entry by suppression of mitochondrial Ca2+ handling. Br J Pharmacol. 137 (6), 821-830 (2002).
  10. Germond, A., Fujita, H., Ichimura, T., Watanabe, T. M. Design and development of genetically encoded fluorescent sensors to monitor intracellular chemical and physical parameters. Biophy. Rev. 8, 121-138 (2016).
  11. Malli, R., Eroglu, E., Waldeck-Weiermair, M., Graier, W. F. Filling a GAP-An Optimized Probe for ER Ca2+ Imaging In Vivo. Cell Chem Biol. 23 (6), 641-643 (2016).
  12. Sato, M., Hida, N., Umezawa, Y. Imaging the nanomolar range of nitric oxide with an amplifier-coupled fluorescent indicator in living cells. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (41), 14515-14520 (2005).
  13. Weidinger, A., Kozlov, A. V. Biological Activities of Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Oxidative Stress versus Signal Transduction. Biomolecules. 5 (2), 472-484 (2015).
  14. Paolo, S. Nitric Oxide in Human Health and Disease. Encyclopedia of life sciences. , (2005).
  15. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
  16. Bonafe, F., Guarnieri, C., Muscari, C. Nitric oxide regulates multiple functions and fate of adult progenitor and stem cells. J Physiol Biochem. 71 (1), 141-153 (2015).
  17. Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur. Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
  18. Dudzinski, D. M., Igarashi, J., Greif, D., Michel, T. The regulation and pharmacology of endothelial nitric oxide synthase. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 46, 235-276 (2006).
  19. Zhou, L., Zhu, D. -. Y. Neuronal nitric oxide synthase: structure, subcellular localization, regulation, and clinical implications. Nitric Oxide. 20 (4), 223-230 (2009).
  20. Aktan, F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sci. 75 (6), 639-653 (2004).
  21. Ghafourifar, P., Cadenas, E. Mitochondrial nitric oxide synthase. Trends Pharmacol Sci. 26 (4), 190-195 (2005).
  22. Crane, B. R., Sudhamsu, J., Patel, B. A. Bacterial nitric oxide synthases. Annu Rev Biochem. 79, 445-470 (2010).
  23. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
  24. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochim Biophys Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
  25. Zhang, Y., et al. Estrogen-related receptors stimulate pyruvate dehydrogenase kinase isoform 4 gene expression. J Biol Chem. 281 (52), 39897-39906 (2006).
  26. Holzmann, S., Kukovetz, W. R., Windischhofer, W., Paschke, E., Graier, W. F. Pharmacologic differentiation between endothelium-dependent relaxations sensitive and resistant to nitro-L-arginine in coronary arteries. J Cardiovasc Pharmacol. 23 (5), 747-756 (1994).
  27. Bentley, M., et al. Vesicular calcium regulates coat retention, fusogenicity, and size of pre-Golgi intermediates. Mol Biol Cell. 21 (6), 1033-1046 (2010).
  28. Ignarro, L. J. Nitric oxide: a unique endogenous signaling molecule in vascular biology. Biosci Rep. 19 (2), 51-71 (1999).
  29. Upreti, M., Kumar, S., Rath, P. C. Replacement of 198MQMDII203 of mouse IRF-1 by 197IPVEVV202 of human IRF-1 abrogates induction of IFN-β, iNOS, and COX-2 gene expression by IRF-1. Biochem Biophys Res Com. 314 (3), 737-744 (2004).
  30. Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo. J Vis Exp. (111), (2016).
  31. de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Na. Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
  32. Latchman, D. S. Transcriptional Gene Regulation in Eukaryotes. Encyclopedia of life sciences. , (2005).
  33. Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. M. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
  34. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
  35. Suarez, S. A., et al. Nitric oxide is reduced to HNO by proton-coupled nucleophilic attack by ascorbate, tyrosine, and other alcohols. A new route to HNO in biological media. J Am Chem Soc. 137 (14), 4720-4727 (2015).
  36. Kuropteva, Z. V., Kudryavtsev, M. E. Ferrous-ascorbate complexes as carriers of nitric oxide. Gen Physiol Biophys. 16 (1), 91-96 (1997).
  37. Vanin, A. F., Huisman, A., Stroes, E. S., Ruijter-Heijstek, F. C., Rabelink, T. J., van Faassen, E. E. Antioxidant capacity of mononitrosyl-iron-dithiocarbamate complexes: implications for NO trapping. Free Radic Biol Med. 30 (8), 813-824 (2001).
  38. Lindberg, R. A., Dewhirst, M. W., Buckley, B. J., Hughes, C. S., Whorton, A. R. Ca2+-dependent nitric oxide release in endothelial but not R3230Ac rat mammary adenocarcinoma cells. Am J Physiol. 271 (1), 332-337 (1996).
  39. Campo, G. M., et al. The SOD mimic MnTM-2-PyP(5+) reduces hyaluronan degradation-induced inflammation in mouse articular chondrocytes stimulated with Fe (II) plus ascorbate. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1610-1619 (2013).
  40. Waldeck-Weiermair, M., et al. Spatiotemporal correlations between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signals using a novel red-shifted mitochondrial targeted cameleon. PLOS ONE. 7 (9), 45917 (2012).
  41. Kuzkaya, N., Weissmann, N., Harrison, D. G., Dikalov, S. Interactions of peroxynitrite with uric acid in the presence of ascorbate and thiols: implications for uncoupling endothelial nitric oxide synthase. Biochem Pharmacol. 70 (3), 343-354 (2005).
  42. Liu, J., Hughes, T. E., Sessa, W. C. The first 35 amino acids and fatty acylation sites determine the molecular targeting of endothelial nitric oxide synthase into the Golgi region of cells: a green fluorescent protein study. J Cell Biol. 137 (7), 1525-1535 (1997).
  43. Feron, O. The Endothelial Nitric-oxide Synthase-Caveolin Regulatory Cycle. J Biol Chem. 273 (6), 3125-3128 (1998).

Tags

Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide ProbesGeNOpsReal-time ImagingNitric Oxide SignalsSingle CellsFluorescence MicroscopeIron(II) Booster SolutionFura-2AMPerfusion ChamberGravity-driven PerfusionPhysiological Calcium Buffer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Eroglu, E., Rost, R., Bischof, H., Blass, S., Schreilechner, A., Gottschalk, B., Depaoli, M. R., Klec, C., Charoensin, S., Madreiter-Sokolowski, C. T., Ramadani, J., Waldeck-Weiermair, M., Graier, W. F., Malli, R. Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO•) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO• Signals in Single Cells. J. Vis. Exp. (121), e55486, doi:10.3791/55486 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image