تطبيق مشفرة وراثيا نيون اكسيد النيتريك (NO •) تحقيقات، وgeNOps، التصوير في الوقت الحقيقي من NO • إشارات في زنازين انفرادية
Summary
This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO•) probes (geNOps) to monitor single cell NO• fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO• formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.
Abstract
أكسيد النيتريك (NO •) هو صغير متطرف، الذي يتوسط متعددة الوظائف الخلوية الهامة في الثدييات، والبكتيريا والنباتات. وعلى الرغم من وجود عدد كبير من الطرق للكشف عن رقم • في المجراة في المختبر، ورصد في الوقت الحقيقي من NO • على مستوى خلية واحدة هو أمر صعب جدا. يتم تحديد تأثيرات فسيولوجية أو مرضية من NO • من التركيز الفعلي ويسكن الوقت من هذا راديكالية. وفقا لذلك، والأساليب التي تتيح الكشف عن خلية واحدة من NO • هي مرغوب فيه للغاية. في الآونة الأخيرة، قمنا بتوسيع البليت من NO • مؤشرات عن طريق إدخال واحد الفلورسنت القائم على البروتين المشفرة وراثيا أكسيد النيتريك (NO •) تحقيقات (geNOps) التي تستجيب مباشرة لالخلوية NO • التقلبات، وبالتالي، يعالج هذه الحاجة. نحن هنا لشرح استخدام geNOps لتقييم الخلايا NO • إشارات ردا على اثنين من المواد الكيميائية المختلفة NO • -liberating الجزيئات. نتائجنا المرضس تأكيد أن طازجة 3- (2-هيدروكسي-1-ميثيل-2-nitrosohydrazino) -N-ميثيل-1-propanamine (NOC-7) لديه قدرة أعلى بكثير لاستحضار التغيير في الخلايا NO • مستويات بالمقارنة مع غير العضوية NO • نتروبروسيد الصوديوم المانحة (SNP). وعلاوة على ذلك، تم إجراء ثنائي اللون الخلية الحية التصوير باستخدام geNOps الأخضر (G-geNOp) والكيميائي الكالسيوم 2+ مؤشر FURA-2 لتصور تنظيم محكم من الكالسيوم 2+ معتمد على NO • تشكيل الخلايا البطانية واحدة. وتبين هذه التجارب التمثيلية التي geNOps هي الأدوات المناسبة للتحقيق في الجيل الوقت الحقيقي، وتدهور وحيدة الخلية NO • إشارات في الاجهزة التجريبية المتنوعة.
Introduction
لقد وضعت مؤخرا فئة جديدة من الفلورسنت NO • تحقيقات المشفرة وراثيا، ودعا geNOps 1. تتكون هذه المجسات من بني ببساطة، البكتيريا تستمد، NO ملزمة • نطاق 2، والذي يضاف إلى البروتين الفلوري متميز (FP) البديل 3 (السماوي والأخضر أو البرتقالي FP). NO • ملزمة لمركز الحديد غير هيم (II) 4 ضمن geNOps يقلل على الفور كثافة مضان 1. الأهم من ذلك، مضان geNOps يتعافى بسرعة وبشكل كامل عند الخلايا NO • مستويات انخفاض 1. وفقا لذلك، geNOps تسمح التصوير في الوقت الحقيقي من (الفرعية) الخلوية NO • التقلبات. على الرغم من أن آلية NO الاستشعار • من geNOps لا تزال غير واضحة حتى الآن، فقد ثبت أن تكون ممتازة NO • للصحفيين، وبالتالي لديها قوة لفتح عهد جديد من متعدد الألوان، كمية NO • bioimaginز مع القرارات المكانية والزمانية عالية 1، 5. تستند الأخرى المتاحة الفلورسنت NO • تحقيقات على مركبات كيميائية صغيرة، والتي تحتاج ليتم تحميلها إلى الخلايا، ويتم تعديلها بشكل لا رجعة فيه من قبل NO • 6. أضرار إضافية من لا • fluorophores صغيرة حساسة هي السمية الخلوية المحتملة ومنخفضة نسبيا خصوصية التي تجعل من الصعب استخدامها في موثوقة والتحليلية وقاطعة بطريقة 7، 8، 9. على الرغم من أن استخدام الفعال للتحقيقات الفلورسنت المشفرة وراثيا يتطلب كفاءة تقنيات نقل الجينات، برزت على أساس FP-أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا كأدوات لا غنى عنها التي أحدثت ثورة في فهمنا للعمل الداخلي للخلايا 10 و 11. قبل تطوير geNOps واحدة على أساس FP، واوörster نقل الطاقة الرنين (الحنق) المستندة إلى NO • استشعار، ويشار إلى، شيد نوا-1 12. ساتو وآخرون. صمم هذا التحقيق المتطورة التي تتكون من وحدتين فرعيتين من NO • -sensitive للذوبان محلقة guanylate (SGC)، وكلاهما مترافق أجهزة الاستشعار القائمة على الحنق لإعداد التقارير دوري غوانوزين الأدينوزين (المركب) مستويات 12. كما يستجيب هذا التحقيق إلى المركب، فإنه يستشعر إلا بصورة غير مباشرة داخل الخلايا NO • تقلبات 12. على الرغم من أن نوا-1 يستجيب لNO • الارتفاعات في نطاق نانو المولي، لم تستخدم هذه الأداة في كثير من الأحيان حتى الآن، وربما يرجع ذلك إلى القيود فيما يتعلق بتوافر والعملي لهذا المستشعر الثنائي ضخمة.
وظائف متعددة من NO •، التي تؤثر جوهريا العمليات البيولوجية وقد تميزت كذلك 13 و 14. أثبتت العديد من الدراسات أن NO • concentratioن داخل الخلايا والنطاقات الفرعية يحدد مصير خلية في الصحة والأمراض 14 و 15 و 16. في mammalians، NO • يتم إنشاؤها أساسا إنزيمي في مختلف أنواع الخلايا من قبل عائلة جيدا اتسم أكسيد النيتريك سينسيز (NOS) 17. حتى الآن، وقد وصفت ثلاثة الإسوية من NOS 18، 19، 20؛ هذه هي كا 2+ / التي تعتمد على كالمودولين البطانية NOS (أنوش أو NOS-3) 18 والعصبية NOS (nNOS أو NOS-1) 19، والكالسيوم 2+ / كالمودولين مستقل نشط بشكل جوهري محرض NOS (iNOS أو NOS- 2) 20. وعلاوة على ذلك، كما تم اقتراح وجود الميتوكوندريا NOS (mtNOS) 21. ومع ذلك، يعتبر mtNOS بوصفها البديل الربط من nNOS، وبالتالي فهي ليست مصنفة على حدة باعتبارها الإسوي 21. الإسوي آخر، وبصرف النظر عن تلك الموجودة في خلايا الثدييات، هو ما يسمى بكتيريا NOS (bNOS)، وجدت أساسا في البكتيريا إيجابية الجرام 22. إنتاج الأنزيمية من NO • يتم التحكم للغاية وتعتمد على توفر العديد من العوامل المساعدة مثل نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد الفوسفات (NADPH)، فلافين ثنائي النوكليوتيد الأدينين (FAD)، tetrahydrobiopterin (BH4)، الأكسجين الجزيئي ولام أرجينين 17. والموجبة الأحماض الأمينية L-أرجينين هو الركيزة التي يتم تحويلها إلى L-سيترولين على NO • إنتاج 17. بالإضافة إلى الجيل الأنزيمية منظم للغاية من NO •، وقد افترض أن جذرية يمكن أن تخفض غير إنزيمي من حمامات النتريت من الميتوكوندريا في ظل ظروف نقص الأوكسجين 23. مرة واحدة ويتم إنتاج NO • داخل الخلية، يمكن أن تنتشر بحرية من خلال biomembranes 14،المرجع "> 15. ومع ذلك، يتم تحديد قصيرة جدا نصف عمر هذا راديكالية أساسا من الظروف البيئية، ومختلف المسارات والتفاعلات الكيميائية تتحلل بكفاءة NO • مستويات 24. في نهاية المطاف، وتشكيل، ونشرها، وتدهور NO • يعتمد على العوامل البيئية المختلفة التي تحدد التركيز الفعال للجزيء غاية نشطة بيولوجيا 24.
التكنولوجيا geNOps يسمح للكشف المباشر (دون) NO الخلوي • تذبذب 1، وبالتالي هي مناسبة لإعادة التحقيق، واكتشاف حديثا الآليات المسؤولة عن تراكم وتحلل الخلوية NO • الإشارات. هنا، ونحن نقدم بروتوكولات بسيطة ونتائج ممثلة لاستخدام geNOps لتصور أثار خارجيا ولدت التطور الطبيعي NO • لمحات، على مستوى الخلايا الفردية. وعلاوة على ذلك، فإن التكنولوجيا geNOps يمكن تكييفها لا ف بالثني في نظم نموذج خلية أخرى لدراسة أنماط معقدة من NO • تشكيل ونشرها، وتدهور في الاستجابة للمؤثرات وضغوط الخلوية المتنوعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
منذ اكتشاف NO • بمثابة جزيء إشارة مهمة في علم الأحياء 28، وقد يتطلع قياس الوقت الحقيقي المحدد للراديكالية في زنازين انفرادية والأنسجة والحيوانات كلها مع ارتفاع القرار بطريقة مجدية ويمكن الاعتماد عليها. نحن هنا نورد تطبيق وضعت مؤخرا الفلورسنت NO • تحقيقات المشفرة وراثيا (geNOps) التي تمكن بالضبط التصوير تعيش خلية من NO • الإشارات باستخدام حقل واسع مضان المجهر 1.
للتحايل على إجراءات ترنسفكأيشن تفصيلا والغازية استنساخ الخلايا كلوة التي تعبر عن مستقر الفلورية الخضراء G-geNOp كان يستخدم لتحديد ولدت خارجيا وحيدة الخلية لا • لمحات. كما خلايا كلوة عادة لا تنتج لا • التطور الطبيعي 29، وهذا نوع من الخلايا هو مناسبة لجيل من خط الخلية استشعار تستند geNOp، والتي قد تكون مفيدة للعديد من التطبيقات الأخرى في ظروف ثقافة مشتركةمع NO • إنتاج الخلايا الأولية أو حتى في الحيوانات الحية 30. ومع ذلك، في هذه الدراسة أن نبرهن على قدرة مختلف المركبات NO • -liberating، من تركيزات وبثبات مختلفة، لاستحضار الخلايا NO • الإشارات باستخدام G-geNOp معربا عن نموذج خلية كلوة. وكشفت البيانات المتوفرة لدينا أن لا • -donor التركيز والجودة وطريقة التطبيق في نهاية المطاف تحديد أنماط NO الخلايا • لمحات. هذه المعلومات لا غنى عنها لفي الموقع توصيف الدوائية المختلفة NO • الجهات المانحة، والتي تدل على العديد من الأمراض. والجدير بالذكر، وقد ثبت geNOps للرد بشكل مستقر إلى التطبيقات المتكررة متعددة من NO • -donor البقول على مدى فترة زمنية طويلة جدا 1. وعليه، فإن التجارب باستخدام NO • -liberating المركبات المقدمة هنا، تسمح الاستنتاجات شبه الكمية المتعلقة بمختلف السعات وحركية NO الخلوية منها226؛ إشارات (الشكلان 1 و 2).
على الرغم من أن التعبير عن مستقر كلوة خلية استنساخ ينشأ على الأرجح من خلية واحدة، لوحظ وجود تباين واسع من مستويات التعبير G-geNOps (الشكل 1). هذا هو سمة مشتركة من الحيوانات المستنسخة خلية مستقرة كما نسخ من الجين (المتكاملة الجينوم) للاهتمام هو تحت سيطرة العديد من العوامل مثل الضغوط البيئية المتنوعة 31 التي تؤثر على معدلات نمو الخلايا 32، ووضع دورة الخلية 33. وgeNOps واحدة على أساس FP-هي تحقيقات غير ratiometric، وبالتالي، فإن NO • -induced فقدان زيادة كثافة مضان مع مستوى التعبير geNOp 1. وفقا لذلك، وتطبيع الإشارات geNOps أمر ضروري لقياس الخلوية NO • إشارات خاصة في حالة وجود تحليل مقارن. كما هو مبين في دراستنا الأخيرة، مشددة الخطية علاقة بإلى صف تم العثور على كثافة مضان القاعدية من geNOps وقوة تبريد مضان NO • -induced على طائفة واسعة من شدة مضان 1. هذا هو سمة هامة من سمات geNOps لتقدير المطلق للالخلوية NO • الإشارات. كما هو مبين في الشكل رقم 1، وتطبيع الإشارات G-geNOps ردا على NOC-7 وكشف SNP متجانسة NO • الإشارات في الخلايا كلوة مختلفة من نفس لوحة، مشيرا إلى أن الخلايا كلوة ليست متنوعة فيما يتعلق قدرتها على تناول وتحط من NO • الراديكالي الذي ينشأ من NO • المانحة. في المقابل، وذلك باستخدام geNOps في خلايا هيلا أظهرت التغاير واضحة الخلوية NO • إشارات بين خلايا مختلفة في الاستجابة لNOC-7. وتشير هذه الاختلافات إلى نوع معين NO • التمثيل الغذائي وتحلل معدلات الخلايا، والتي قد يكون لها آثار متعددة في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض الخلوي، ويمكن الكشف عنها باستخدام geNOpالصورة التكنولوجيا.
ومع ذلك، فقد لاعتبار اثنين من السمات الهامة لgeNOps بعناية للاستخدام الصحيح للأجهزة الاستشعار وتفسيرات البيانات: ط) geNOps تتطلب الحديد الكافي (II) إلى الاستجابة الكاملة لNO • 1 و ب) تبعا لمتغير FP، يمكن geNOps يكون الرقم الهيدروجيني الحساسة 1. نحن هنا وصف البروتوكول الذي تم جدت لتكون مناسبة للالحديد غير سام (II) مكملات geNOps، التي يتم التعبير عنها في أي كلوة، هيلا أو خلايا EA.hy926 (انظر بروتوكول 2.6). بينما ثبت أن العلاج بالخلايا مع الحديد (II) / فيتامين C لم يؤثر على شكل الخلية، بقاء الخلية والنشاط الأيضي للخلايا 1، قد يكون من الضروري لتحسين هذه خطوة هامة لأنواع أخرى من الخلايا والأنسجة. ومع ذلك، في بعض الظروف التجريبية، ومتطلبات الحديد (II) تحميل قد تحد من مدى انطباق geNOps. والجدير بالذكر، فقد تبين أن أسكوربات يمكن أن تقلل NO • 35 و أسكوربات الحديد (II) المجمعات قادرة على كنس NO • 36 و 37. وعلاوة على ذلك، يمكن أن الحديد الزائد (II) وأسكوربات تحفز الاستجابات الالتهابية 39 و أنوش فك الارتباط بين 41. تحتاج إلى أخذها في الاعتبار عند استخدام التكنولوجيا geNOps هذه الآثار. فقد تبين أنه في ظل بعض الظروف التجريبية، ودرجة الحموضة داخل الخلايا يتأثر بشكل كبير 34، والتي لديها القدرة على التأثير على geNOps مضان 1. والجدير بالذكر أن السماوي والأخضر geNOps المتغيرات هي درجة الحموضة نسبيا حساسة تظهر انخفاضا من مضان على تحمض 1. وبالتالي، والتغيرات الحادة لل(الفرعية) الرقم الهيدروجيني الخلوية قد محاكاة NO كاذبة • إشارات عند استخدام geNOps حساسة درجة الحموضة. كما اقترح في عملنا السابق، والاستخدام الموازي للNO • geNOps حساسة (geNOps موت) كما كنترول السلبيةفمن المستحسن ليرة سورية لتشريح حقيقية الخلوية NO • إشارة من درجة الحموضة تغييرات 1. وبالإضافة إلى ذلك يمكن أن تفقد تغييرات درجة الحموضة الخلوية باستخدام مجسات درجة الحموضة مثل SypHer 34.
وعلاوة على ذلك، فإننا تصور الأنزيمية NO • تشكيل الذاتية ردا على الفسيولوجية الكالسيوم 2+ -mobilizing ناهض في الخلية البطانية البديلة EA.hy926. خط الخلية EA.hy926 هو نظام النموذج المستخدم في كثير من الأحيان التعبير عن الدوام أنوش 38. استخدام geNOps أعرب عابر في الخلايا EA.hy926، وأكد أن الملكية الفكرية 3 بوساطة إشارات الكالسيوم 2+ تثير عميق NO • تشكيل في هذا نوع من الخلايا، والذي تم حظره تماما تقريبا L-NNA. من أجل ربط الزمان الكالسيوم 2+ مع NO • الإشارات، تم تحميل خلايا G-geNOp، معربا عن مع الأشعة فوق البنفسجية منفعل الكيميائية الكالسيوم 2+ -المؤشر FURA-2 / صباحا. الفصل الطيفي للكا 2+ ملزمة وغير منضم FURA-2 فلوو rescence من الإشارة G-geNOp يمكن أن يتحقق بسهولة مع تجاريا مرشح متاح يحدد 40. كشفت التصوير على حد سواء تحقيقات التي كا 2+ الأنزيمية -triggered NO • تشكيل يحدث أبطأ بكثير بالمقارنة مع ارتفاع الكالسيوم عصاري خلوي 2+ في هذا نوع من الخلايا البطانية. تم الإبلاغ عن حركية مماثلة من خلية واحدة لا • الإشارات في الخلايا البطانية من الشريان الرئوي البقري على العلاج بالخلايا مع IP 3 -generating البراديكينين ناهض، وكذلك الضغوط القص باستخدام نوا-1، وهي غير مباشر استشعار NO غاية • -sensitive 12 . وبناء على ذلك، تؤكد هذه البيانات التي كا 2+ -evoked أنوش المستمدة-NO • تشكيل يتطلب وقتا انطلاق معينة حتى يتم الوصول إلى النشاط الأنزيمي الكامل. على الرغم من أن حركية الخلوية NO • تشكيل ونشر وتدهور يمكن استخلاصها من البيانات الأخرى، مثل القياسات المأخوذة من التوتر NO • -induced استرخاء الأوعيةSS = "XREF"> 26، وفائدة كبيرة من NO فلوري • تحقيقات هو أنها مباشرة تحويل الخلوية NO • تقلبات إلى إشارات مرئية في الوقت الحقيقي. وبالتالي، والتصوير NO الخلوي • إشارات مع geNOps يوفر القرار المكانية والزمانية عالية، وتقدم إمكانيات فريدة من نوعها في (إعادة) التحقيق في (دون) الخلوية NO • التوازن. على سبيل المثال، والتصوير أنوش مكوكية 42 في تركيبة مع التكنولوجيا geNOps في الخلايا البطانية واحدة قد تكون مناسبة لربط NO • تشكيل لتوطين التحت خلوية والنبات من NO. • -producing الانزيم أو البروتينات الأخرى ذات الصلة مثل كالمودولين وcaveolin 43.
نحن هنا وصف التطبيق العملي من G-geNOp معربا عن كلوة وEA.hy926 خلايا لتصور خارجيا والتطور الطبيعي ولدت الخلوية NO • الإشارات على مستوى وحيدة الخلية وفي الوقت الحقيقي على التقليدية واسعة مضان الحقل مicroscope. يعني بياناتنا أن geNOps هي مناسبة لتتبع تحديدا (الفرعية) الخلوية NO • ديناميات تحت ظروف تجريبية مختلفة باستخدام كل أنواع من أنواع الخلايا مثيرة للاهتمام.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge C.J. Edgell, Pathology Department, University of North Carolina at Chapel Hill, NC, USA for providing the EA.hy926 cells. Author E.E. is supported by Nikon Austria within the Nikon-Center of Excellence, Graz and is a fellow of the Ph.D. program in Molecular Medicine at the Medical University of Graz. The researchers are also supported by the Ph.D. program Metabolic and Cardiovascular Disease (DK-W1226) of the Medical University of Graz. This work was also funded by the FWF project P 28529-B27. Microscopic equipment is part of the Nikon-Center of Excellence, Graz that is supported by the Austrian infrastructure program 2013/2014, Nikon Austria Inc., and BioTechMed, Graz.
Materials
| NaCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.20 | sodium chloride |
| KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.1 | potassium chloride |
| CaCl2 .2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T885.1 | calcium chloride dihydrate |
| MgCl2 .6H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | magnesium chloride hexahydrate |
| HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.3 | 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8551.1 | sodium hydrogencarbonate |
| KH2PO4 | Merck, Darmstadt, Germany | 104873 | potassium dihydrogen phosphate |
| Na2HPO4 .2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.1 | sodium hydrogenphosphate dihydrate |
| D(+)-Glucose monohydrate | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6780.1 | >99.5%; for cell culture, endotoxin free; |
| EGTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3054.2 | ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid; calcium chelating agent |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6771.1 | sodium hydroxide |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4625.1 | hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N) |
| DMSO | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4720.1 | dimethyl sulfoxide; highly polar, aprotic organic solvent |
| L-Glutamic acid hydrochloride | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | G2128 | (S)-2-Aminoglutaric acid |
| DMEM, low glucose | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | D5523 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose; with 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
| MEM Vitamin solution (100X) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11120037 | 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
| MEM Amino acids solution (50X) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11130036 | 50X the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122.00 | antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures |
| Amphotericin B | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15290026.00 | Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi |
| FCS | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270106 | Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin |
| PBS, pH 7.4 | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010031.00 | phosphate-buffered saline |
| Fura-2 (AM) | Teflabs, Austin, TX, USA | 102 | fluorescent cytosolic calcium indicators |
| Histamine dihydrochlorid | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | H7250 | 2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist |
| Nω-Nitro-L-arginine | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | N5501 | N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA; inhibitor of nitric oxide synthase |
| NOC-7 | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 487952 | 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release |
| Sodium nitroprusside dihydrate | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-203395A | sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound |
| 30-mm Cover slips | Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany | 41001130 | glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30-mm, (VE: 100 pcs.) |
| Iron(II) booster solution | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells; http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/ |
| G-geNOp plasmid | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product/g-genop/ |
| G-geNOp AAV5 | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/ |
| G-geNOp sensor cell line | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/ |
| HEK293A cell line | Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R70507 | subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) |
| EA.hy926 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany | CRL-2922 | somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549 |
| TILL iMIC | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | digital microscope |
| Polychrome V monochromator | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | ultra fast switching |
| AVT Stingray F145B | Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany | n.a. | Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b |
| alpha Plan Fluar 40 | Zeiss, Göttingen, Germany | n.a. | x40 objective |
| dichroic filters | Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA | n.a. | GFP emitter 514/3 nm (515dcxr) |
| ValveBank8 Controller | AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA | 01-08 | programmable perfusion system control unit |
| BVC control | Vacuubrand, Wertheim, Germany | 727200 | Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system |
| ImageJ software | NIH Image | Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome |
References
- Eroglu, E., et al. Development of novel FP-based probes for live-cell imaging of nitric oxide dynamics. Nat Commun. 7, 10623 (2016).
- Bush, M., et al. The structural basis for enhancer-dependent assembly and activation of the AAA transcriptional activator NorR. Mo. Microbiol. 95 (1), 17-30 (2015).
- Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nat. Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
- D’Autréaux, B., Tucker, N., Spiro, S., Dixon, R., Poole, e. d. .. P. o. o. l. e. ,. R. .. K. .. ,. (. e. d. ). .. ,. Characterization of the Nitric Oxide-Reactive Transcriptional Activator NorR. Globins and Other Nitric Oxide-Reactive Proteins, Part B. 437, 235-251 (2008).
- Strack, R. Sensors and probes: Yes to genetically encoded NO• sensors. Nat Methods. 13 (4), 288 (2016).
- Auten, R. L. Response to ‘The use of diaminofluorescein for nitric oxide detection: Conceptual and methodological distinction between NO and nitrosation. Free Radic. Biol. Med. 50 (12), 1812 (2011).
- Sivaraman, G., Anand, T., Chellappa, D. A Fluorescence Switch for the Detection of Nitric Oxide and Histidine and Its Application in Live Cell Imaging. ChemPlusChem. 79 (12), 1761-1766 (2014).
- Ye, X., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Detection of nitric oxide in single cells. Analyst. 133 (4), 423-433 (2008).
- Thyagarajan, B., Malli, R., Schmidt, K., Graier, W. F., Groschner, K. Nitric oxide inhibits capacitative Ca2+ entry by suppression of mitochondrial Ca2+ handling. Br J Pharmacol. 137 (6), 821-830 (2002).
- Germond, A., Fujita, H., Ichimura, T., Watanabe, T. M. Design and development of genetically encoded fluorescent sensors to monitor intracellular chemical and physical parameters. Biophy. Rev. 8, 121-138 (2016).
- Malli, R., Eroglu, E., Waldeck-Weiermair, M., Graier, W. F. Filling a GAP-An Optimized Probe for ER Ca2+ Imaging In Vivo. Cell Chem Biol. 23 (6), 641-643 (2016).
- Sato, M., Hida, N., Umezawa, Y. Imaging the nanomolar range of nitric oxide with an amplifier-coupled fluorescent indicator in living cells. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (41), 14515-14520 (2005).
- Weidinger, A., Kozlov, A. V. Biological Activities of Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Oxidative Stress versus Signal Transduction. Biomolecules. 5 (2), 472-484 (2015).
- Paolo, S. Nitric Oxide in Human Health and Disease. Encyclopedia of life sciences. , (2005).
- Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
- Bonafe, F., Guarnieri, C., Muscari, C. Nitric oxide regulates multiple functions and fate of adult progenitor and stem cells. J Physiol Biochem. 71 (1), 141-153 (2015).
- Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur. Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
- Dudzinski, D. M., Igarashi, J., Greif, D., Michel, T. The regulation and pharmacology of endothelial nitric oxide synthase. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 46, 235-276 (2006).
- Zhou, L., Zhu, D. -. Y. Neuronal nitric oxide synthase: structure, subcellular localization, regulation, and clinical implications. Nitric Oxide. 20 (4), 223-230 (2009).
- Aktan, F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sci. 75 (6), 639-653 (2004).
- Ghafourifar, P., Cadenas, E. Mitochondrial nitric oxide synthase. Trends Pharmacol Sci. 26 (4), 190-195 (2005).
- Crane, B. R., Sudhamsu, J., Patel, B. A. Bacterial nitric oxide synthases. Annu Rev Biochem. 79, 445-470 (2010).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
- Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochim Biophys Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
- Zhang, Y., et al. Estrogen-related receptors stimulate pyruvate dehydrogenase kinase isoform 4 gene expression. J Biol Chem. 281 (52), 39897-39906 (2006).
- Holzmann, S., Kukovetz, W. R., Windischhofer, W., Paschke, E., Graier, W. F. Pharmacologic differentiation between endothelium-dependent relaxations sensitive and resistant to nitro-L-arginine in coronary arteries. J Cardiovasc Pharmacol. 23 (5), 747-756 (1994).
- Bentley, M., et al. Vesicular calcium regulates coat retention, fusogenicity, and size of pre-Golgi intermediates. Mol Biol Cell. 21 (6), 1033-1046 (2010).
- Ignarro, L. J. Nitric oxide: a unique endogenous signaling molecule in vascular biology. Biosci Rep. 19 (2), 51-71 (1999).
- Upreti, M., Kumar, S., Rath, P. C. Replacement of 198MQMDII203 of mouse IRF-1 by 197IPVEVV202 of human IRF-1 abrogates induction of IFN-β, iNOS, and COX-2 gene expression by IRF-1. Biochem Biophys Res Com. 314 (3), 737-744 (2004).
- Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo. J Vis Exp. (111), (2016).
- de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Na. Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
- Latchman, D. S. Transcriptional Gene Regulation in Eukaryotes. Encyclopedia of life sciences. , (2005).
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. M. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
- Suarez, S. A., et al. Nitric oxide is reduced to HNO by proton-coupled nucleophilic attack by ascorbate, tyrosine, and other alcohols. A new route to HNO in biological media. J Am Chem Soc. 137 (14), 4720-4727 (2015).
- Kuropteva, Z. V., Kudryavtsev, M. E. Ferrous-ascorbate complexes as carriers of nitric oxide. Gen Physiol Biophys. 16 (1), 91-96 (1997).
- Vanin, A. F., Huisman, A., Stroes, E. S., Ruijter-Heijstek, F. C., Rabelink, T. J., van Faassen, E. E. Antioxidant capacity of mononitrosyl-iron-dithiocarbamate complexes: implications for NO trapping. Free Radic Biol Med. 30 (8), 813-824 (2001).
- Lindberg, R. A., Dewhirst, M. W., Buckley, B. J., Hughes, C. S., Whorton, A. R. Ca2+-dependent nitric oxide release in endothelial but not R3230Ac rat mammary adenocarcinoma cells. Am J Physiol. 271 (1), 332-337 (1996).
- Campo, G. M., et al. The SOD mimic MnTM-2-PyP(5+) reduces hyaluronan degradation-induced inflammation in mouse articular chondrocytes stimulated with Fe (II) plus ascorbate. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1610-1619 (2013).
- Waldeck-Weiermair, M., et al. Spatiotemporal correlations between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signals using a novel red-shifted mitochondrial targeted cameleon. PLOS ONE. 7 (9), 45917 (2012).
- Kuzkaya, N., Weissmann, N., Harrison, D. G., Dikalov, S. Interactions of peroxynitrite with uric acid in the presence of ascorbate and thiols: implications for uncoupling endothelial nitric oxide synthase. Biochem Pharmacol. 70 (3), 343-354 (2005).
- Liu, J., Hughes, T. E., Sessa, W. C. The first 35 amino acids and fatty acylation sites determine the molecular targeting of endothelial nitric oxide synthase into the Golgi region of cells: a green fluorescent protein study. J Cell Biol. 137 (7), 1525-1535 (1997).
- Feron, O. The Endothelial Nitric-oxide Synthase-Caveolin Regulatory Cycle. J Biol Chem. 273 (6), 3125-3128 (1998).
