Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

За последние несколько десятилетий, значительные достижения были сделаны в разработке аналитических методов , предназначенных для измерения белковой структуры и динамики ^{1, 2, 3, 4.} В то время как рентгеновская кристаллография остается принцип инструмента для определения структуры белка, высокие концентрации белка необходимы и обширные оптимизации требуются для получения кристаллов дифракционного качества. Белки, которые трудно кристаллизуется, такие как ассоциированные с мембранами и внутренне неупорядоченными белки классически были изучены с помощью водородного обмена-дейтерия (HDX) ЯМРА ^5. Тем не менее, в последние десятилетия, связь с электрораспылением ионизации масс – спектрометрии (ESI-MS) на HDX быстро завоевала популярность ^{6, 7.}

Масс-спектрометрия предлагает решениеко многим из ограничений, связанных с рентгеновской кристаллографии и ЯМР. В частности, МС обладает высокой чувствительностью (нМ до концентрации мкМ требуется), и не существует практически никаких ограничений на размер белка. Кроме того, высокий рабочий цикл анализа MS допускает возможность изучения белков, поскольку они подвергаются ферментативному обороту, неправильный фолдинг, комплексообразование и других биологически соответствующих процессы. Эти процессы часто происходят на миллисекунды до второй шкалы времени и требуют быстрого смешивания реагентов до анализа.

Развитие Времяразрешенной ионизации электрораспыления (TRESI) Вильсон и Konermann в 2003 году, разрешенных реакций, подлежащий мониторинг в псевдо-режиме реального времени с помощью ESI-MS. Их установка включена капиллярный смеситель с плавно регулируемым реакционным объемом камеры ^8. Устройство состоит из двух концентрических капилляров, с внутренним капилляром запечатанного и насечкой разрежет на его сторону, чтобы обеспечить смешивание в узком интер-капилляреу пространства от надреза до конца внутреннего капилляра (обычно 2 мм). При нанесении на опытах HDX, внутренний капиллярная несет белок , представляющий интерес, наружный капиллярная несет на маркировку D ₂ O раствор, который затем подвергается смешивания с белком перед входом в регулируемой реакционной камеры , что позволяет для маркировки HDX до прямой передачи в ESI источник.

Если коротко, то HDX полагается на магистральных амидных водородах , проходящих обмен с атомами дейтерия в растворе ^{9, 10.} Обмен катализируемой основанием при физиологическом рН, с кислотно-катализ становится распространенным при рН ниже примерно 2,6. Скорость обмена основана на четыре основных факторах: рН, температура, доступность растворителя и внутримолекулярные водородные связи. В первых два фактора поддерживается постоянным в течение всего эксперимента, скорость обмена, особенно на пептидном остове позиции амидной, в первую очередь dependenт на структуру белка ^11. Плотно сложенные участки с обширными, стабильных водородных связей сетей в альфа-спиралей и бета-листов будет занимать дейтерий , по существу , более медленными темпами по сравнению с петлями и неупорядоченных областей (а иногда и не на всех) ^12. Это позволяет для глобального анализа белков, где возмущение в структуре (например., После агрегации или связывание субстрата) приводит к различному поглощению дейтерия (рисунок 1).

Кинетическая капиллярная смеситель может быть включена в микрожидкую платформу, содержащей протеолитическую камеру для локализации поглощения дейтерия. Эта протеолитическая камера удерживается при низком значении рНа в целях эффективного гашения реакции обмена, и требует иммобилизованной кислоты протеазы, чтобы переварить белка в локализованные пептиды (рисунок 2). Мониторинг магистральной обмен на миллисекундах до вторых временных масштабов особенно важна дляхарактеристика конформационных изменений в пределах трудно охарактеризовать областей петли, расплавленные глобулы и внутренне неупорядоченные белки (ВПЛ) ^{13, 14.} В качестве альтернативы, TRESI-HDX может также использоваться , чтобы характеризовать белки , которые в настоящее время не имеют решаемой атомную структуру с помощью методов рентгеновской кристаллографии и ЯМР, используя обмен дейтерия в сочетании с алгоритмом COREX (DX-COREX) подход ^{15, 16.} Этот подробный протокол будет применяться TRESI-HDX для изучения тау, МВУ, в обоих его нативной формы, а также это патогенные гиперфосфорилированного состояние. В то время как родной тау является одним из наиболее хорошо изученных ВПЛ, мало известно о его амилоидогенном аналоге ^13.