Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

In den letzten Jahrzehnten haben bedeutende Fortschritte bei der Entwicklung von analytischen Techniken entworfen worden , um die Proteinstruktur und Dynamik ^{1, 2, 3, 4} zu messen. Während Röntgenkristallographie das Prinzip Werkzeug zur Bestimmung der Proteinstruktur, hohe Konzentrationen an Protein bleibt benötigt werden und umfangreiche Optimierung erforderlich Diffraktionsqualität Kristalle zu erzeugen. Proteine , die schwer zu kristallisieren, wie beispielsweise membranassoziiertes und intrinsisch ungeordneten Proteine klassisch durch Wasserstoff-Deuterium – Austausch (HDX) NMR ⁵ untersucht worden. Doch in den letzten Jahrzehnten Kopplung von Elektrospray – Ionisations – Massenspektrometrie (ESI-MS) zu HDX hat sich schnell an Popularität gewann ^{6, 7.}

Die Massenspektrometrie bietet eine Lösungzu viele der durch Röntgenkristallographie und NMR gestellt Einschränkungen. Insbesondere MS ist sehr empfindlich (nM bis uM Konzentrationen erforderlich), und es gibt praktisch keine Begrenzung für Proteingröße. Darüber hinaus ermöglicht die hohe Tastgrad von MS-Analyse der Möglichkeit von Proteinen zu studieren, wie sie enzymatischen Umsatz, misfolding, Komplexierung und andere biologisch relevante Prozesse unterzogen werden. Diese Prozesse treten häufig auf den von Millisekunden bis Sekunden Zeitskala und erfordern eine schnelle Vermischung von Reagenzien vor der Analyse.

Die Entwicklung des Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisation (Tresi) von Wilson und Konermann 2003 erlaubten Reaktionen in pseudo-Echtzeit durch ESI-MS überwacht werden. Ihre Einrichtung einen kapillaren Mischer mit einem stufenlos einstellbaren Reaktionskammervolumen ⁸ eingebaut. Die Vorrichtung besteht aus zwei konzentrischen Kapillaren, mit der inneren Kapillare abgedichtet und einer Kerbe in die Seite geschnitten zum Mischen innerhalb des engen inter Kapillarsystem zu ermöglicheny Raum von der Kerbe zu dem Ende der inneren Kapillare (typischerweise 2 mm). Wenn auf HDX Experimente angewandt, wobei die innere Kapillare das Protein von Interesse trägt, trägt die äußerte Kapillare die Kennzeichnung D ₂ O – Lösung, die dann mit dem Protein erfährt vermischt , bevor das einstellbare Reaktionskammer eintretenden zum Etikettieren von HDX ermöglicht vor dem direkten Transfer in die ESI Quelle.

Kurz gesagt, verlässt sich HDX auf Wasserstoffe Rückgrat Amid mit Deuteriumatomen in Lösung ^{9, 10} unterzogen Austausch. Der Austausch ist basenkatalysierte bei physiologischem pH-Wert, mit Säure-Katalyse bei pH 2,6 unter etwa verbreitet zu werden. Der Wechselkurs basiert auf vier Hauptfaktoren: pH, Temperatur, Lösungsmittelzugänglichkeit und intramolekulare Wasserstoffbindung. Da die ersten beiden Faktoren konstant während des gesamten Versuchs gehalten werden, ist der Wechselkurs, insbesondere bei Peptidgerüst Amid Positionen, in erster Linie dependent auf die Proteinstruktur ^11. Dicht Regionen gefaltet mit umfangreichen, stabilen Wasserstoffbrücken – Netzwerken in α-Helices und β-Faltblätter werden Deuterium bei wesentlich geringeren Geschwindigkeiten im Vergleich zu Schleifen und ungeordneten Bereiche (und manchmal gar nicht) ¹² aufzunehmen. Dies ermöglicht eine globale Proteinanalyse, in den Störungen in der Struktur (z. B. bei der Aggregation oder Substratbindung) führen zu unterschiedlicher Deuterium Aufnahme (Abbildung 1).

Die kinetischen kapillaren Mischer können in eine Mikrofluidik-Plattform integriert werden, um eine proteolytische Kammer für die Lokalisierung der Deuterium-Aufnahme enthält. Diese proteolytische Kammer wird bei niedrigem pH – Wert gehalten , um effektiv die Austauschreaktion zu auslöschen, und erfordert eine immobilisierte Säure – Protease, um das Protein in lokalisierte Peptide (Abbildung 2) zu verdauen. Überwachung Backbone Austausch in Millisekunden bis Sekunden Zeitskalen ist besonders wichtig für dieCharakterisierung von Konformationsänderungen innerhalb schwierig Schleifenregionen, geschmolzene Kügelchen und intrinsisch ungeordnete Proteine (IDPs) ^{13, 14} zu charakterisieren. Alternativ kann Tresi-HDX auch Proteine verwendet werden , zu charakterisieren , die derzeit keine gelöste Atomstruktur durch die Verfahren der Röntgenkristallographie und NMR haben, Deuterium – Austausch mit dem COREX – Algorithmus gekoppelt unter Verwendung von (DX-COREX) Ansatz ^{15, 16.} Dieses detaillierte Protokoll Tresi-HDX gilt tau zu studieren, ein IDP, sowohl sie als auch nativer Form ist, wie es pathogen hyperphosphorylated Zustand. Während einheimischer tau eine der gut untersucht IDPs ist, ist nur wenig über sein amyloidogenen Gegenstück ¹³ bekannt.