Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

In de afgelopen jaren zijn aanzienlijke vooruitgangen geboekt bij de ontwikkeling van analytische technieken ter eiwitstructuur en dynamica ^{1, 2, 3, 4} meten. Terwijl röntgenkristallografie blijft het principe voor het bepalen van eiwitstructuur worden hoge concentraties van eiwitten nodig en uitgebreide optimalisering vereist diffractie Kristallen produceren. Eiwitten die moeilijk te kristalliseren zijn, zoals membraangeassocieerd en intrinsiek ontvouwen eiwitten zijn klassiek bestudeerd door waterstof-deuterium uitwisseling (HDX) NMR ^5. Echter, de laatste decennia koppeling van electrospray ionisatie massaspectrometrie (ESI-MS) naar HDX is snel aan populariteit ^{6, 7.}

Massaspectrometrie biedt een oplossingveel van de beperkingen veroorzaakt door röntgen kristallografie en NMR. Vooral MS zeer gevoelig (nM tot pM concentraties vereist), en er vrijwel geen grens aan eiwitgrootte. Daarnaast is de hoge inschakelduur MS analyse maakt de mogelijkheid bestuderen eiwitten ze enzymatisch omzet, verkeerd vouwen, complexering en andere biologisch relevante processen ondergaan. Deze processen treden vaak op de milliseconde tweede tijdschaal en vereisen snel mengen van reagentia voorafgaand aan analyse.

De ontwikkeling van tijdsopgeloste elektrosprayionisatie (Tresi) door Wilson en KONERMANN in 2003 toegestaan ​​reacties te kunnen houden in pseudo-real time door ESI-MS. Hun opstelling opgenomen een capillair mixer met een traploos verstelbare reactiekamer volume ^8. De inrichting bestaat uit twee concentrische capillairen, met binnencapillair afgesloten en een inkeping in de zijkant gesneden om voor het mengen in de smalle inter-capillairy ruimte van de inkeping aan het uiteinde van de binnenste capillair (typisch 2 mm). Toegepast op HDX experimenten, de binnencapillair draagt het eiwit van belang, de uitwendige capillaire draagt het etiket _D2O oplossing, die vervolgens ondergaat mengen met het eiwit alvorens de instelbare reactiekamer waardoor HDX etiket vóór directe overdracht in de ESI bron.

In het kort HDX voert backbone amide waterstoffen ondergaan uitwisseling met deuterium atomen in oplossing ^{9, 10.} De uitwisseling van base gekatalyseerde bij fysiologische pH, met een zuur-katalyse steeds heersende pH beneden ongeveer 2,6. De koers is gebaseerd op vier factoren: pH, temperatuur, oplosmiddel toegankelijkheid en intramoleculaire waterstofbinding. Als de eerste twee factoren gedurende het experiment, de koers, vooral in peptide hoofdketen amide posities constant worden gehouden, primair dependentaan eiwitstructuur ^11. Strak gevouwen gebieden met uitgebreide, stabiele waterstofbinding netwerken α-helices en β-sheets zal nemen deuterium in hoofdzaak langzamer vergeleken met lussen en ongeordende gebieden (en soms helemaal niet) ^12. Dit maakt globale eiwitanalyse, waarbij verstoringen in structuur (bijv., Na aggregatie of substraatbinding) leiden tot verschillende deuterium opname (figuur 1).

De kinetische capillaire menger in een microfluïdisch platform met een proteolytisch kamer voor lokalisatie van het deuterium opname worden opgenomen. Deze proteolytische kamer wordt gehouden bij lage pH om effectief blussen de uitwisselingsreactie en vereist een geïmmobiliseerd zuur protease om het eiwit te verteren in gelokaliseerde peptiden (figuur 2). Monitoring backbone uitwisseling op milliseconde naar tweede tijdschalen is vooral belangrijk voor dekarakterisering van conformationele veranderingen binnen moeilijk lusgebieden gesmolten globules en intrinsiek ontvouwen eiwitten (IDP) ^{13, 14} te karakteriseren. Als alternatief kunnen Tresi-HDX ook worden gebruikt om eiwitten die momenteel een opgelost atoomstructuur door de werkwijzen van röntgenkristallografie en NMR geen kenmerkend gebruik deuterium uitwisseling gekoppeld met de COREX-algoritme (DX-COREX) benadering ^{15, 16.} Deze gedetailleerde protocol Tresi-HDX gelden voor tau, een IDP bestuderen, zowel in het oorspronkelijke vorm, alsmede het pathogene hypergefosforyleerde toestand. Terwijl inheemse tau is een van de meest goed bestudeerd ontheemden, is er weinig bekend over de amyloïdogene tegenhanger ^13.