Purificación de ADN de alto peso molecular genómico de oídio para Long-Read Sequencing

Cenicillas son un grupo de obligado planta de hongos patógenos que biotrófica, tomados en conjunto, son la principal causa de enfermedades de las plantas en todo el mundo ^1. Hay más de 900 especies descritas de oídio, que se han agrupado en cinco tribus taxonómicamente dentro de la familia Erisyphaceae ^2. Debido tanto a su importancia económica y la relación íntima que desarrollan con sus anfitriones, las enfermedades de moho han sido objeto de investigación para> 100 años. Tras la infección, oídios provocan cambios drásticos en la estructura celular, el metabolismo y la biología molecular de sus anfitriones, en beneficio de este patógeno. Sin embargo, el estudio de oídios es particularmente difícil debido a su estilo de vida obligado, y el crecimiento del hongo en cultivo puro todavía no se ha descrito ^{3, 4, 5,}"xref"> ^{6, 7, 8.} Fiable transformación, estable genética de cenicillas aún no ha logrado también ha sido, a pesar de la transformación transitoria se ha reportado en algunas especies ^{9, 10.}

La secuenciación y ensamblaje de genomas de moho en polvo ha demostrado ser difícil debido a una serie de características de la propia genoma. Genomas de moho en polvo son grandes (120 a 180 Mbp) en relación con otros genomas de hongos, y se componen de 60 – 90% de elementos repetitivos distribuidas uniformemente ^11. Estos elementos incluyen repeticiones terminales no largos, así como elementos repetitivos no categorizados. Dos formas especiales de una sola especie oídio, Blumeria graminis f. sp. hordei y f. sp. tritici (Bgh y Bgt, respectivamente), así como el polvo de uva moho Erysiphe necator, tienen abejan secuenciaron, y los proyectos de genomas de varios otros se han completado ^{12, 13, 14.} La naturaleza repetitiva de los genomas ha hecho ensamblaje difícil, y el genoma Bgh terminado fue ensamblado en 6.989 supercontigs con un L50 de 2 Mb ^12.

A pesar del gran genoma, los oídios parecen tener un pequeño número de genes de proteínas de codificación, con 5.845 y 6.540 genes predichos en Bgh y Bgt, respectivamente. Los mildius pulverulentos secuenciados también parecen carecer de al menos 99 genes esenciales que son esenciales en otros hongos, que es consistente con la dependencia de los hongos en su planta huésped para la supervivencia ^{11, 12, 13, 14.}

Las secuencias repetitivas cerca de telómeros, centrómeros, RN ribosomalA arrays y regiones enriquecidas en elementos de transposición de genes están mal ensambladas a partir de estrategias de secuenciación-leer cortas y son a menudo insuficientemente representadas en asambleas del genoma ^15. Se cree que estas regiones para ser responsable de muchos de los huecos que se producen en secuencias del genoma, y esto se aplica a los oídios con su amplia expansión de elementos repetitivos ^16. Altamente regiones del genoma de plástico se encuentran a menudo en tales regiones repetitivas ^3. Ellos sirven como un sitio de reordenamientos cromosómicos y, a menudo codifican genes bajo fuerte presión selectiva, tales como los genes que codifican las proteínas efectoras y los genes que codifican enzimas del metabolismo secundario. Los avances en una sola molécula de tecnologías de secuenciación de lectura larga proporcionan una solución potencial para la secuenciación a través de las regiones repetitivas de genomas ^15. Por ejemplo, FAINO et al. (2015) encontraron que la inclusión de la secuencia larga leer tecnologías y m ópticoapping les permitió producir una secuencia de genoma GAP-menos por dos cepas de la planta de hongos patógenos dalia Verticillium, triplicando la proporción de secuencias repetitivas de ADN en el genoma, aumentando el número de anotaciones de genes (y reducir el número de parcial o falta anotaciones de genes ) y el genoma revelador reordenamientos ^17.

Para emplear estas tecnologías de secuenciación de larga leer, altas concentraciones de ADN genómico de alta calidad, con un mínimo de tamaños> 20 kpb, son necesarios. Aquí describimos nuestros métodos para la recolección de conidial, la purificación de ADN de alto peso molecular a partir de conidios y nuestras evaluaciones de control de calidad utilizando las especies de moho en polvo Golovinomyces cichoracearum cultivadas en pepino ^18. Este protocolo se basa en un protocolo desarrollado en el grupo de laboratorio B. Keller (Universidad de Zürich, Zürich Suiza) ^{13, 19}e incluye varias modificaciones que condujeron a un aumento de los rendimientos de ADN y una mayor proporción de ADN> 48,5 kpb de tamaño. El protocolo también incluye medidas de control de calidad basado en las recomendaciones del Departamento de Energía de los Estados Unidos Joint Genome Institute ^{20, 21, 22.}

La función de cada reactivo incluido en el tampón de lisis, y la justificación de cada etapa de purificación, son como se describe en Henry (2008) ^23. Disponibles protocolos publicados para el aislamiento de ADN genómico de alto peso molecular a partir de tejidos vegetales y microbianas también fueron consultados durante el diseño de este protocolo ^{24, 25, 26, 27, 28.}