Очистка ДНК с высоким молекулярным весом геномной от мучнистой росы для Long-Read Sequencing

Мучнисторосяных представляют собой группу облигатных биотрофных грибковых патогены растений , которые, взятые вместе, являются основной причиной болезни растений во всем мире ^1. Есть более 900 описанных видов мучнистой росы, которые таксономически сгруппированные в пять племен в семье Erisyphaceae ^2. В связи как их экономическое значение, и интимные отношения они развиваются со своими хозяевами, мучнистая роса заболевания были предметом исследования для> 100 лет. После заражения, настоящая мучнистая роса вызывают резкие изменения в клеточной структуре, метаболизма и молекулярной биологии их хозяев, в пользу этого патогена. Тем не менее, изучение мучнисторосяных является особенно сложной задачей из – за их облигатным образ жизни, и рост гриба в чистой культуре до сих пор не было описано ^{3, 4, 5,}"Xref"> ^{6, 7, 8.} Надежная, стабильная генетическая трансформация мучнисторосяных также еще не была достигнута, хотя переходное преобразование было сообщено в некоторых видах ^{9, 10.}

Последовательность и монтаж мучнистой росы геномов оказались трудными из-за ряд особенностей самого генома. Мучнистая роса геном крупный (120 – 180 МВРА) по отношению к другим грибковым геном, и состоят из 60 – 90% равномерно распределенных повторяющихся элементов ^11. Эти элементы включают в себя не-длинные концевые повторы, а также неклассифицированные повторяющиеся элементы. Два formae speciales одного вида мучнистой росе, Blumeria graminis ф. зр. hordei и е. зр. tritici (BGH и Bgt, соответственно), а также мучнистая роса винограда Erysiphe Necator, у пчелп секвенирования и проект геномы для ряда других были завершены ^{12, 13, 14.} Повторяющийся характер геномов сделал сборку трудным, и заполненный BGH геном был собран в 6,989 supercontigs с L50 2 Мб ^12.

Несмотря на большое генома, то настоящая мучнистая роса , как представляется, небольшое количество белковых генов , кодирующих, с 5,845 и 6,540 генов предсказанных в BGH и БГТ, соответственно. Виртуализированное мучнистая роса также , кажется, не имеют , по крайней мере 99 основных генов, которые необходимы в других грибов, что согласуется с зависимостью грибов на их растения – хозяина для выживания ^{11, 12, 13, 14.}

Повторяющиеся последовательности вблизи теломеры, центромеры, рибосомальной Р.Н.Ген , массивы и область , обогащенная мобильных элементы плохо собраны из коротких чтения стратегий секвенирования и часто недостаточно представлены в геноме сборках ^15. Такие области , как полагает, ответственны за многие пробела , которые происходят в геномных последовательностях, и это относится к мучнисторосяным с их экстенсивным расширением повторяющихся элементов ^16. Высококвалифицированный пластические участки генома часто встречается в таких повторяющихся областях ^3. Они служат в качестве сайта хромосомных перестроек и часто кодируют гены под сильным селективным давлением, такие как гены, кодирующие эффекторные белки и гены, кодирующие ферменты вторичного метаболизма. Прогресс в одной молекуле давно прочитанных технологии секвенирования обеспечивает потенциальное решение для секвенирования через повторяющиеся области геномов ^15. Например, Файно и др. (2015) обнаружил, что в том числе длинных последовательностей чтения технологии и оптический мapping позволили им производить последовательность генома разрыва менее двух штаммов грибковых растений патогенов Verticillium георгина, утроение доли повторяющихся последовательностей ДНК в геноме, увеличивая количество генных аннотаций (и сокращение числа частичного или отсутствуют ген аннотации ) и выявление перестроек генома ^17.

Для того, чтобы использовать эти длинные читаемые технологии секвенирования, высокие концентрации высокого качества геномной ДНК, с минимальными размерами> 20 т.п.н., необходимо. Здесь мы опишем наши методы конидий сбора, очистки ДНК высокой молекулярной массы от конидий и наши оценки контроля качества с использованием мучнистой росы видов Golovinomyces cichoracearum , выращенные на огурце ^18. Этот протокол основан на протоколе , разработанном в лаборатории группы В. Келлера (Университет Цюриха, Цюрих Швейцария) ^{13, 19}и включает в себя несколько модификаций, которые привели к повышению урожайности ДНК и более высокую долю ДНК> 48,5 т.п.н. в размере. Протокол также включает в себя этапы контроля качества на основе рекомендаций департамента Соединенных Штатов энергетики Объединенного института генома ^{20, 21, 22.}

Функция каждого реагента , включенный в буфере для лизиса, и обоснования для каждой стадии очистки, такой , как описана в Генри (2008) ^23. Доступные опубликованные протоколы для изоляции с высокой молекулярной массой геномной ДНК из растений и микроорганизмов , тканей были также проведены консультации в ходе разработки этого протокола ^{24, 25, 26, 27, 28.}