Purificação de DNA de alto peso molecular genômico de oídio de longo Read Sequencing

Oídios são um grupo de obrigatório planta fúngico biotrófica agentes patogénicos que, quando tomados em conjunto, são a maior causa de doenças de plantas em todo o mundo ^1. Existem mais de 900 espécies descritas de oídio, que foram taxonomicamente agrupadas em cinco tribos dentro da família Erisyphaceae ^2. Devido tanto à sua importância econômica e a íntima relação que desenvolvem com seus anfitriões, doenças de oídio foram objecto de investigação por> 100 anos. Após a infecção, oídio provocar mudanças drásticas na estrutura celular, metabolismo e biologia molecular de seus hospedeiros, para beneficiar deste patógeno. No entanto, o estudo de oídios é particularmente difícil devido ao seu estilo de vida obrigatória, e o crescimento do fungo em cultura pura ainda não foi descrito ^{3, 4, 5,}"xref"> ^{6, 7, 8.} Reliable transformação, estável genética de oídios ainda não foi também conseguida, embora a expressão transiente tem sido relatada em algumas espécies ^{9, 10.}

O sequenciamento e montagem de genomas oídio tem sido difícil devido a uma série de características do próprio genoma. Genomas oídio são grandes (120-180 MBP) em relação a outros genomas de fungos, e consistem em 60 – 90% de elementos repetitivos uniformemente distribuídas ^11. Estes elementos incluem repeties terminais longas não, bem como elementos repetitivos não classificadas. Dois speciales formae de uma única espécie de oídio, Blumeria graminis f. sp. hordei e f. sp. tritici (BGH e Bgt, respectivamente), bem como o míldio pulverulento da uva Erysiphe necator, têm abelhan sequenciado, e os projectos de genomas de vários outros foram concluídos ^{12, 13, 14.} A natureza repetitiva dos genomas fez montagem difícil, e o genoma Bgh completada foi montado em 6.989 supercontigs com um L50 de 2 Mb ^12.

Apesar do grande genoma, os míldios pulverulentos parecem ter um pequeno número de genes que codificam proteínas, com 5.845 e 6.540 genes previstos em Bgh e Bgt, respectivamente. Os oídios sequenciados também parecem carecer de pelo menos 99 genes principais que são essenciais em outros fungos, o que é consistente com a dependência dos fungos na sua planta hospedeira para a sobrevivência ^{de 11, 12, 13, 14.}

seqüências repetitivas perto telômeros, centrômeros, RN ribossomalA matrizes e as regiões enriquecidas em elementos transponíveis de genes são mal montada a partir de estratégias de sequenciação de curto-ler e são frequentemente sub-representados em conjuntos de ¹⁵ genoma. Tais regiões são pensados para ser responsável por muitas das lacunas que ocorrem em sequências do genoma, e isto aplica-se aos míldios pulverulentos, com o seu grande expansão de elementos repetitivos ^16. Altamente regiões do genoma de plástico são freqüentemente encontrados nessas regiões repetitivas ^3. Eles servem como um local de rearranjos de cromossomas e muitas vezes codificam genes sob forte pressão selectiva, tais como os genes que codificam para proteínas efectoras e os genes que codificam as enzimas do metabolismo secundário. Advances in única molécula de tecnologias de sequenciação de leitura longa fornecer uma solução potencial para a sequenciação através das regiões repetitivas de genomas ^15. Por exemplo, Faino et al. (2015) verificaram que a inclusão de sequência de leitura longa e tecnologias m ópticoapping lhes permitiu produzir uma sequência de genoma lacuna-menos para duas estirpes de planta fúngico patógeno dália Verticillium, triplicando a proporção de sequências repetitivas de ADN no genoma, aumentando o número de notas de genes (e a redução do número de parcial ou ausente anotações gene ) e revelador genoma rearranjos ^17.

Para empregar estas tecnologias de sequenciamento de leitura longa, altas concentrações de DNA genômico de alta qualidade, com o mínimo de tamanhos> 20 kbp, são necessários. Descrevemos aqui os nossos métodos para a recolha de conídios, purificação de DNA de alto peso molecular a partir de conídios e nossas avaliações de controlo de qualidade utilizando as espécies de oídio Golovinomyces cichoracearum cultivadas em pepino ^18. Este protocolo baseia-se num protocolo desenvolvido no laboratório grupo B. Keller (Universidade de Zurique, Zurique Suíça) ^{13, 19}e inclui várias modificações que levaram ao aumento da produção de ADN e uma proporção mais elevada de ADN de> 48,5 kpb em tamanho. O protocolo também inclui etapas de controle de qualidade com base nas recomendações do Departamento de Estados Unidos da Joint Genome Institute Energia ^{20, 21, 22.}

A função de cada um dos reagentes incluídos no tampão de lise, e a razão para cada passo de purificação, são como descrito em Henry (2008) ^23. Disponíveis protocolos publicados para o isolamento de DNA de alto peso molecular genómico a partir de tecidos de plantas e microbianas foram também consultados durante a concepção deste protocolo ^{24, 25, 26, 27, 28.}