Reinigung von High Molecular Weight genomischer DNA aus Echten Mehltaus für Long-Read-Sequenzierung

Echte Mehltaupilze sind eine Gruppe von obligater biotrophen pilzliche Pflanzenpathogene , dass, wenn sie zusammengenommen, ist die größte Ursache für Pflanzenkrankheiten weltweit ^1. Es gibt über 900 beschriebene Arten von Mehltau, der taxonomisch in fünf Stämme innerhalb der Familie Erisyphaceae ² zusammengefasst wurde. Sowohl auf ihre wirtschaftlichen Bedeutung und die intimen Beziehung, die sie mit ihren Wirten zu entwickeln haben, Mehltau Krankheiten für> 100 Jahre sind der Gegenstand der Forschung. Bei Infektion, entlocken Echte Mehltau drastische Veränderungen in der Zellstruktur, den Stoffwechsel und Molekularbiologie ihrer Wirte, diese Erreger zu profitieren. Das Studium der Echten Mehltau ist jedoch besonders schwierig aufgrund ihres obligater Lebensstil, und das Wachstum des Pilzes in Reinkultur ist noch nicht ³ beschrieben ^{wurde, 4, 5,}"Xref"> ^{6, 7, 8.} Zuverlässige, stabile genetische Transformation von Echten Mehltau hat auch noch nicht erreicht worden, obwohl transiente Transformation ⁹ bei einigen Arten ^{berichtet, 10.}

Die Sequenzierung und Montage von Echtem Mehltau Genome hat sich als schwierig erwiesen, aufgrund einer Reihe von Merkmalen des Genoms selbst. Mehltaus Genomen sind groß (120-180 MBP) relativ zu anderen Pilz-Genomen, und bestehen aus 60 bis 90% gleichmäßig verteilt repetitiven Elementen ^11. Diese Elemente sind nicht-long terminal repeats, sowie uncategorized repetitive Elemente. Zwei formae speciales einer einzigen echten Mehltau – Arten, Blumeria graminis f. sp. hordei und f. sp. tritici (Bgh und Bgt, respectively) sowie die Traubenmehltau Erysiphe necator, haben Bienenn sequenziert und Entwurf Genomen für mehr andere wurde ^{12 abgeschlossen, 13, 14.} Die sich wiederholenden Natur der Genome hat Montage erschwert und das fertige Bgh – Genom wurde in 6.989 supercontigs mit L50 von 2 Mb ¹² montiert.

Trotz des großen Genoms scheint der Echte Mehltau eine kleine Anzahl von Protein – kodierenden Genen zu haben, mit 5.845 und 6.540 Genen vorhergesagt in Bgh und Bgt ist. Die sequenzierten echte Mehltaue scheinen auch mindestens 99 Kern Gene zu fehlen , die in anderen Pilzen wesentlich sind, die mit der Abhängigkeit der Pilze auf ihrer Wirtspflanze für das Überleben ^{11, 12, 13, 14} im Einklang steht.

Repetitive Sequenzen nahe Telomere, Centromere, ribosomale RNEin Gen – Arrays und Regionen in transponierbaren Elementen angereichert sind schlecht aus Kurz gelesen Sequenzierungsstrategien zusammengesetzt und sind oft unterrepräsentiert in Genomanordnungen ^15. Solche Bereiche für viele der Lücken verantwortlich sein wird angenommen , dass in Genomsequenzen auftreten, und dies gilt auch für die echte Mehltaue mit ihren umfangreichen Erweiterung von repetitiven Elementen ^16. Highly Kunststoff Genomregionen oft in einem solchen repetitiven Regionen ³ gefunden. Sie dienen als Gebiet von Chromosomenumlagerungen und oft codieren Gene unter starkem Selektionsdruck, wie beispielsweise die Gene, die für Proteine ​​Effektor und die Gene Enzyme des Sekundärstoffwechsels kodieren. Die Fortschritte in der Einzelmolekül – Lang lesen Sequenzierungstechnologien bieten eine mögliche Lösung für die Sequenzierung durch sich wiederholende Regionen von Genomen ^15. Zum Beispiel Faino et al. (2015) fanden heraus, dass auch lange Sequenz gelesen Technologien und m optischenapping ließ sie für zwei Stämme der pilzliche Pflanzenpathogen Verticillium Dahlia eine lückenlose Genomsequenz erzeugen, den Anteil der sich wiederholenden DNA – Sequenzen in das Genom zu verdreifachen, die Anzahl der Gen Annotationen erhöht (und die Verringerung der Anzahl von Teil oder fehlende Gen Annotationen ) und aufschlussreich Genom – Rearrangements ^17.

Um diese langfris las Sequenzierungstechnologien, hohe Konzentrationen von hohen Qualität genomischer DNA, mit minimalen Größen> 20 kbp zu verwenden, benötigt. Hier beschreiben wir unsere Methoden zur konidiale Sammlung, Reinigung von hochmolekularer DNA von Konidien und unsere Qualitätskontrolle Einschätzungen Mehltauart Golovinomyces cichoracearum auf Gurken angebaut mit ^18. Dieses Protokoll basiert auf einem Protokoll im Labor Gruppe B. Keller entwickelt (Universität Zürich, Zürich Schweiz) ^{13, 19}und umfasst mehrere Modifikationen, die zu einem erhöhten DNA-Ausbeuten und einen höheren Anteil an DNA> 48,5 kbp in Größe geführt. Das Protokoll enthält auch die Qualitätskontrolle Schritte basieren auf den Empfehlungen aus den Vereinigten Staaten Department of Energy Joint Genome Institute ^{20, 21, 22.}

Die Funktion jedes Reagenz in dem Lysepuffer enthalten ist , und die Gründe für jeden Reinigungsschritt werden , wie in Henry (2008) ²³ beschrieben. Verfügbare veröffentlichte Protokolle zur Isolierung von hochmolekulare genomische DNA aus pflanzlichen und mikrobiellen Geweben wurden auch bei der Gestaltung dieses Protokolls ^{24, 25, 26 angehört, 27, 28.}